成纤维细胞激活蛋白对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

唐婷婷

[摘要] 目的 通过体外实验研究成纤维细胞激活蛋白（Fibroblast activation protein，FAP）对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响。 方法 体外培养人类卵巢癌细胞系0VCAR3，用不同浓度的FAP（0、0.0625、0.125、0.25、0.5及1 μg/mL）处理24 h或48 h后，通过MTT法检测FAP对卵巢癌细胞增殖的影响。0VCAR3用不同浓度的FAP（0、0.0625、0.25及1 μg/mL）处理48 h后，通过流式细胞术检测FAP 对OVCAR3细胞凋亡的影响。 结果 MTT法示FAP可促进卵巢癌细胞OVCAR3增殖，其作用呈时间、剂量依赖性（P<0.05）;流式细胞术示FAP对卵巢癌细胞系OVCAR3的细胞凋亡率并无明显影响（P>0.05）。 结论 FAP可促进卵巢癌细胞系OVCAR3的增殖，对其凋亡水平无明显影响。

[关键词] 成纤维细胞激活蛋白;卵巢癌细胞OVCAR3;增殖;凋亡

[中图分类号] R737.31          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）36-0034-03

Effect of fibroblast activation protein on proliferation and apoptosis of ovarian cancer cell

TANG Tingting

Department of Gynecology and Obstetrics， the Fourth People's Hospital of Shenyang City， Shenyang   110031， China

[Abstract] Objective To explore the effect of FAP on proliferation and apoptosis of ovarian cancer cell through in vitro experiment. Methods Human ovarian cancer cell line OVCAR3 was cultured in vitro and treated with FAP at different concentrations （0， 0.0625， 0.125， 0.25， 0.5 and 1 μg/mL） for 24 or 48 hours. The effect of FAP on ovarian cancer cell proliferation was detected by MTT assay after treatment. After OVCAR3 was treated with FAP at different concentrations （0， 0.0625， 0.25 and 1 μg/mL） for 48 hours， the effect of FAP on OVCAR3 apoptosis was detected by flow cytometry. Results It was shown by the MTT assay that FAP could promote OVCAR3 proliferation in a time-and dose-dependent manner （P<0.05）. It was shown by the flow cytometry that FAP had no significant effect on the apoptosis rate of ovarian cancer cell line OVCAR3 （P>0.05）. Conclusion FAP can promote the proliferation of ovarian cancer cell line OVCAR3 but has no significant effect on its apoptosis level.

[Key words] Fibroblast activation protein; Ovarian cancer cell OVCAR3; Proliferation; Apoptosis

卵巢惡性肿瘤是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一，卵巢恶性上皮性肿瘤的死亡率居妇科恶性肿瘤首位，并已成为严重威胁妇女生命和健康的主要肿瘤[1]。越来越多的研究发现，肿瘤不仅由癌基因和抑癌基因来调控，还依赖于由间质形成的微环境的作用[2]。肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast，CAF）是肿瘤间质的主要成分，对肿瘤的发生、发展起着关键作用。作为CAF的特异性标志物的成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein，FAP，又称Seprase）是一种膜结合糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族，能专一性水解多肽巾脯氨酸残基的氨基端肽键，具有二肽基肽酶和胶原酶的活性[3]。FAP已被证实主要在上皮性肿瘤的基质成纤维细胞中表达，它的存在可促进肿瘤微血管的形成，对肿瘤的浸润、转移及逆转具有重要意义[4]。

本研究通过体外培养卵巢癌细胞系OVCAR3，体外给予不同浓度的FAP处理，通过MTT和流式细胞术检测FPA对卵巢癌细胞系增殖凋亡的影响，旨在探讨FPA与卵巢癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 一般材料

人卵巢癌OVCAR3细胞株由中国医科大学馈赠。用10%胎牛血清（BoMei公司）的RPMI-1640培养基（Hyclone公司）培养，四甲基偶氮唑盐（MTT）（凯基），二甲基亚枫（DMSO）（凯基），重组FAP蛋白（SB公司），细胞凋亡检测试剂盒（凯基公司），其余试剂均为东北制药集团公司生产。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养  人卵巢癌OVCAR3细胞株由中国医科大学馈赠。细胞培养：将OVCAR3细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃、5%CO2恒温箱中培养，每48小时换液1次，当细胞长满瓶壁的80%～90%时，用0.25%胰酶消化，按1∶3比例进行传代培养。

1.2.2 MTT比色法测增殖实验  将OVCAR3细胞（3.0×104/mL）接种于96孔板中，用含5% FBS的培养基培养24 h。每个96孔板均分为6组，每组设4个复孔;24 h后，每板上的6组分别加入无血清培养基（N）、FAP蛋白（1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL，各浓度4个复孔）处理;于0、24、48 h各取出一块96孔板，加入新鲜配制的MTT溶液继续培养4 h。离心吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜，振荡10 min，充分溶解结晶。以空白孔调零，酶标测定仪检测490 nm波长下的光吸收值（OD值）。

1.2.3流式細胞仪测细胞周期  将OVCAR3细胞（1.0×104/mL）接种于6孔板，共9组;24 h后分别加入等量的无胎牛血清培养基，FAP蛋白（0.5、0.375、0.25、0.1875、0.125、0.09375、0.0625、0.04687 μg/mL），每组2个复孔;继续培养48 h后，消化孔板中的OVCAR3细胞，将等量的细胞悬液与PI染液混合，4℃放置30 min，流式细胞仪488 nm激发波长测定细胞周期。Annexin V/PI双染流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法

全部数据采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异，采用SNK法进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FAP可影响OVCAR3细胞的增殖

在OVCAR3细胞培养基中加入不同浓度FAP（0、0.0625、0.125、0.25、0.5及1 μg/mL）处理24 h或48 h，MTT法检测FAP 对OVCAR3细胞增殖能力的影响。结果表明，FAP处理24 h后，各浓度细胞增殖能力均明显升高。FAP处理48 h后，各浓度细胞增殖能力进一步显著增加。体外加入不同浓度FAP，对卵巢癌细胞系OVCAR3均具有明显的促增殖作用，并呈现出剂量依赖性（图1）;且FAP对卵巢癌细胞系OVCAR3的促增殖作用随时间逐渐增强（图2）。

2.2 FAP对OVCAR3细胞凋亡的影响

在OVCAR3细胞培养基中加入不同浓度FAP（0、0.0625、0.25及1 μg/mL）处理48 h后，流式细胞术Annexin V/PI双染检测FAP对OVCAR3细胞凋亡的影响。结果显示对照组（FAP 0 μg/mL）OVCAR3细胞凋亡率为（8.35±0.44）%。不同浓度FAP（0.0625、0.25及1 μg/mL）处理48 h后，OVCAR3细胞凋亡率并无明显改变，分别为（8.85±0.73）%、（8.25±1.12）%及（10.00±1.58）%（图3）。

图3   不同浓度FAP处理后OVCAR3细胞凋亡率比较

3 讨论

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第3位。在各类妇科肿瘤中，卵巢上皮癌的死亡率居于首位，对女性生命造成严重威胁，其中以上皮癌最多见[5-6]。卵巢上皮癌患者手术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占30%，大多已扩散到子宫、双侧附件、大网膜及盆腔各器官[7]。卵巢癌的发病病因并不明确，这就导致难以早期做出正确诊断，没有一级预防措施。目前，现有研究表明卵巢癌的发生可能与以下几个方面有关：癌症发病外部因素（包括化学、物理、生物等致癌因子）、癌症发病内部因素（包括免疫功能、内分泌、遗传、精神因素等）及饮食营养失调和不良生活习惯等[8-10]。

成纤维细胞活化蛋白FAP存在于肿瘤基质成纤维细胞中，在细胞表面发挥作用，是一种膜丝氨酸肽酶，是Ⅱ型丝氨酸蛋白酶家族成员之一，具有二肽基肽酶及胶原酶活性，在肿瘤的生长中具有双重功能[11-12]。FAP的蛋白水解酶活性可增强肿瘤细胞对细胞外基质的侵袭力，同样也能促进肿瘤的生长和增殖。故以FAP作为靶点的分子成像及作为肿瘤基质标志物的病理诊断、肿瘤基因治疗或免疫治疗将成为可能。FAP表达于90%以上的上皮性肿瘤的基质成纤维细胞的胞膜和胞浆中，包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌。FAP阳性细胞靠近肿瘤毛细血管的内皮细胞并围绕着肿瘤结节，但在正常成人的组织、良性和癌前病变的上皮性损伤中通常不表达[13-15]。

本研究首先应用MTT法检测FAP对卵巢癌细胞增殖的影响。在人卵巢癌细胞系OVCAR3培养基中加入不同浓度的FAP处理24 h或48 h后，OVCAR3细胞的增殖能力明显提高，且随时间推移逐渐增加。表明不同浓度FAP对卵巢癌细胞系OVCAR3均具有明显的促增殖作用，并呈现出剂量依赖性，且FAP对卵巢癌细胞系OVCAR3的促增殖作用随时间逐渐增强。其次，应用流式细胞术Annexin V/PI双染法检测FAP 对卵巢癌细胞凋亡的影响。结果表明，用不同浓度FAP（0、0.0625、0.25及1 μg/mL）处理OVCAR3细胞48 h后，各组OVCAR3细胞凋亡率略有差异，但无统计学意义。即FAP对卵巢癌细胞系OVCAR3的细胞凋亡率并无明显影响。

本研究表明，体外给予FAP可促进卵巢癌细胞系OVCAR3的增殖且有时间和剂量依赖性。FAP并未显著影响卵巢癌细胞系OVCAR3的凋亡水平。

综上所述，FAP在肿瘤的发生发展中起重要作用，对它们的深入研究将有助于阐明卵巢癌的发病机制、协助临床诊断和评估病情，同时为卵巢癌的综合治疗提供更有益的帮助。

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（收稿日期：2019-08-08）