KIF20A在胃癌中的表达与预后的关系

盛 燚，张尚鑫，闫 强，孙若川，李德关，鲁明典，张 震，李永翔

1982年，KIF家族被首次发现存在于鱿鱼细胞中，随后普遍在真核生物中检出。研究[1]显示KIF家族是一类具有轴突运输功能的分子马达，参与细胞分裂。2005年，首次发现驱动蛋白家族成员20A(kinesin family member 20A, KIF20A)在胰腺癌中高度表达，在体外条件下用siRNA抑制胰腺癌细胞KIF20A的表达后，细胞的增殖被明显抑制[2]。自此KIF20A在肿瘤中的作用开始倍受关注。体外研究[3]表明，一些KIF20A衍生肽能够产生针对KIF20A阳性和HLA-A2阳性胰腺癌细胞的细胞毒T淋巴细胞，从而识别并诱导癌细胞的死亡，而对正常细胞无细胞毒反应，这表明了其在靶向治疗上的可能性。不久之后，针对KIF20A在胰腺癌的I/II期临床试验更是取得了令人满意的成果[4-5]。简而言之，KIF20A可能是一个十分有潜力的肿瘤标志物和治疗靶点。然而，KIF20A在癌细胞中的高度表达是否具有普遍性，及其在肿瘤中的生物学功能机制仍然是未知的。该研究通过检测KIF20A在胃癌中的表达水平，分析其与临床病理特征和预后的关系，并调控其表达探究对胃癌细胞系增殖的影响，为胃癌的临床预后评估和靶向治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1材料经医院伦理委员会批准，以及患者知情同意并签字后，于安徽医科大学第一附属医院胃肠外科收集胃癌患者的手术后肿瘤样本。第一批样本为37对胃癌组织及配对癌旁组织，取样后加入RNA保存液，之后立刻储存于-80 ℃冰箱，用qRT-PCR检测表达。第二批样本为122例患者术后胃癌组织和随机选取的24例癌旁组织，取样后用福尔马林浸泡并石蜡包埋，制作成组织微阵列(TMA)，用免疫组化染色检测表达。人胃癌细胞系AGS来自上海生命科学院，用于细胞增殖实验。

1.2主要试剂和方法

1.2.1主要试剂 TransZol Up RNA提取试剂盒购自北京Transgen公司；第一链cDNA合成试剂盒、荧光定量试剂盒购自瑞士Roche公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、鼠/兔二抗购自上海碧云天公司；鼠一抗购自美国Abcam公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；超级ECL发光试剂盒、KIF20A抗体购自美国Thermo Fisher公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素和PBS溶液购自澳大利亚Gibco公司；siRNA-KIF20A购自美国Santa Cruz公司；CellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 按照TransZol试剂盒说明书提取总RNA。按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，KIF20A正向引物5′-ACTTTGCGGCTATGCGAGGAT-3′，反向引物5′-TGAGAA GATGCTGTGACTGCG-3′，β-actin正向引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反向引物: 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。qRT-PCR的反应条件包括: 95 ℃ 5 min预变性，然后按95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共做45个循环，最后72 ℃ 5 min延伸。以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.2.3Western blot实验 RIPA法提取蛋白后按照BCA试剂盒说明书检测蛋白浓度，配制20 μl蛋白量体系。经SDS-PAGE胶电泳后，转至PVDF膜上。经5%脱脂牛奶封闭1 h后，于4 ℃冰箱一抗(KIF20A按1 ∶1 000稀释，β-actin按1 ∶3 000稀释)孵育过夜。TBST洗3次，每次10 min，二抗(1 ∶3 000)孵育2 h，再次清洗后使用增强化学发光法显影。

1.2.4免疫组化 将组织切片进行HE染色，观察并取样典型胃癌组织，制作为组织微阵列。将组织微阵列放入50 ℃烘箱，烘烤2 h，全自动染色机中脱蜡，乙醇脱水，超纯水洗涤后柠檬酸抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，滴加KIF20A一抗(1 ∶2 000)4 ℃冰箱过夜，PBS洗涤，滴加兔二抗，孵育1 h，DAB 显色，苏木精复染后封片。使用兔血清替代一抗重复实验作为阴性对照。由两名经验丰富的病理医师对组织微阵列进行判读和评分，染色强度计分：无染色记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分；阳性细胞数计分：0%记0分，<25%记1 分，25% ～ 75%记2分，>75%记3分。免疫活性计分(IRS)=染色强度计分×阳性细胞数计分。IRS≤2记为阴性，将IRS>2记为阳性，从而将所有样本分为阴性和阳性两组。

1.2.5细胞培养与转染 AGS细胞系采用混有10%胎牛血清和1%的抗生素(青霉素/链霉素)的RPMI-1640培养液。培养在5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中。待细胞系处于对数生长期，按照sc-91657说明书进行转染，24 h后提取总RNA和蛋白并进行后续试验。

1.2.6细胞活力实验 成功转染后，待细胞系处于对数生长期。细胞计数，制备密度为3×104个/ml的细胞悬液1 ml。分别取100 μl细胞悬液，以3 000个/孔的密度种植于96孔板中。培养72 h后，各孔中加入Cell Titer-Glo试剂20 μl，轻轻混匀后室温静置10 min，在多孔板酶标仪上检测获取数据。

1.3统计学处理使用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用配对t检验，验证KIF20A mRNA在胃癌及其癌旁组织中的表达情况。KIF20A表达高低与临床病理特征的关系采用Pearson χ2检验。采用Kaplan-Meier方法制作生存曲线。采用Log-Rank检验进行临床病理特征及KIF20A表达与总生存期间的单因素分析。采用独立样本t检验来验证细胞系增殖的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1KIF20A在胃癌中高表达为了研究胃癌中KIF20A基因表达情况，在37对胃癌及配对癌旁组织中检测KIF20A mRNA表达，发现其中27例胃癌患者的KIF20A基因在转录水平高于其癌旁组织(P<0.05)，见图1。之后在包含了122例胃癌组织和24例随机癌旁组织的组织微阵列中进行免疫组化染色，可以发现KIF20A主要表达于胞质中(图2A)。如图2B所示，根据免疫组化评分结果，胃癌组织中的KIF20A阳性表达(54.92%)明显高于其癌旁组织(29.17%)(P<0.001)。实验结果分别从转录和翻译水平验证了在胃癌中KIF20A表达均是上调的。

图1 胃癌及其癌旁组织中KIF20A mRNA的相对表达

2.2KIF20A表达与临床病理特征的关系结合临床病理资料，用χ2检验来验证KIF20A基因表达与临床病理参数的关系。表1显示，KIF20A表达与胃癌病理分化有关(P=0.036)，但KIF20A与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤浸润程度、淋巴结转移和TNM分期无关。

表1 胃癌患者中KIF20A表达与临床病理特征的关系

图2 胃癌组织及其癌旁正常组织中KIF20A的蛋白表达

A：免疫组化图；a：KIF20A在胃癌组织中的阳性表达；b：KIF20A在胃癌组织中的阴性表达；c：KIF20A在癌旁正常组织中的阴性表达；1：×100；2：×200；B：免疫组化法检测胃癌和正常组织KIF20A蛋白表达；与癌旁组织比较：*P<0.05

2.3KIF20A表达与预后的关系采用Log-Rank检验法分析了KIF20A表达与预后之间的关系。针对KIF20A表达在胃癌中的生存分析显示，KIF20A高表达的胃癌患者总生存期为(40.16±24.65)月，相较于KIF20A低表达的胃癌患者(48.91±21.84)月明显偏低(P=0.022)，见图3。综上所述，KIF20A可作为胃癌的一个独立预后风险因子。

2.4KIF20A对AGS细胞增殖能力的影响鉴于KIF20A的高表达可能与胃癌进展有密切关系，在体外水平探索KIF20A对胃癌细胞增殖能力的影响。利用siRNA转染AGS细胞系，并成功下调了KIF20A的表达(P=0.005)，见图4A、4B。采用CellTiter-Glo法检测AGS细胞系的增殖能力。如图4C所示，在体外水平，下调KIF20A基因表达能明显抑制AGS细胞增殖能力(P<0.001)。

图3 Kaplan-Meier生存曲线 KIF20A表达与胃癌患者术后总生存期的关系

3 讨论

作为驱动蛋白-6亚家族之一，KIF20A是一种微管相关马达蛋白，其生物学功能主要参与细胞分裂，以及细胞器或细胞膜的转运等细胞活动[6]。近期有越来越多的研究发现KIF20A的上调与癌症相关。2005年，KIF20A被首次发现在胰腺癌中过表达，而在体外水平采用siRNA下调KIF20A基因表达后能抑制胰腺癌细胞的增殖[2]。研究发现KIF20A在肝癌细胞中过表达，而正常肝细胞中KIF20A几乎不表达，沉默肝癌细胞中KIF20A基因的表达会导致细胞染色体多倍体化，这种现象与KIF20A能够促进细胞分裂和增殖但不会诱导细胞凋亡的功能基本一致[7]。更有研究发现在正常组织中，KIF20A在胎儿肝脏、成人胸腺和骨髓中高表达，在胎盘和成人心脏中低表达，在成人脑、肺、肝、脾、肾、骨骼肌和淋巴中不表达[8]。此外，研究发现针对KIF20A的衍生肽可以诱导产生对胰腺癌细胞具有免疫杀伤功能的细胞毒T细胞，而对正常细胞几乎无害[9]。随之开展的针对KIF20A在胰腺癌的一些I/II期临床实验中，也取得了成功。这些研究都说明了KIF20A很可能是癌症中一个极有潜力的肿瘤治疗靶点。但是其潜在的分子机制仍不十分清楚，而且KIF20A与胃癌的关系也不清楚。

本研究qRT-PCR和免疫组化显示，相较于正常对照，胃癌中KIF20A在转录和翻译水平均高表达，这提示了KIF20A在胃癌中可能扮演着促癌基因的作用。通过组织微阵列结果，结合临床病理资料发现，KIF20A高表达与胃癌组织分化程度差显著相关。结合胃癌患者随访资料，通过生存分析显示，KIF20A高表达的胃癌患者总生存期更短。上述结果提示KIF20A的高表达可能是参与胃癌发展、迁移等过程的关键基因。在初步体外试验中，发现沉默KIF20A的表达后，胃癌细胞的增殖能力受到明显抑制，这为胃癌靶向治疗提供了一个新的可能性。

本实验依然存在一些不足之处。首先，在生物学功能上，可以进行细胞侵袭和迁移试验，来验证癌细胞KIF20A高表达是否能够增强肿瘤的侵袭和迁移能力。其次，细胞死亡形式包括细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬和有丝分裂灾变等。而KIF20A在细胞分裂中占有重要地位，探索KIF20A在上述细胞死亡形式特别是有丝分裂灾变过程中是否具有重要作用以及怎样的作用是我们进一步的研究方向。

图4 siRNA转染AGS细胞后对细胞增殖的影响

A：转染siRNA后KIF20A mRNA的表达降低；B：转染siRNA后KIF20A蛋白的表达降低；C：转染siRNA后AGS细胞增殖能力下降；与siRNA-NC组比较：*P<0.05

综上所述，KIF20A在胃癌中高度表达，也是胃癌中一个独立预后风险因子。此外，沉默KIF20A抑制了胃癌细胞增殖，提示了KIF20A在胃癌中可能发挥着癌基因的作用，并很可能是一个新的胃癌治疗靶点。进一步研究其潜在分子机制，能够为胃癌的靶向治疗提供新的策略。