间充质干细胞来源外泌体在皮肤损伤修复中的研究进展

孙璇 ，毛念渝 ，刘明珠 ，董传明 .南通大学杏林学院，江苏南通 600；.南通大学医学院，江苏南通 600

皮肤约占人体表面积的70%，是人体最大的器官，具有保护身体、排汗、感觉温度变化、同时还参与机体免疫反应。常见的皮肤损伤包括创伤、烫伤、烧伤等，其中难愈性皮肤损伤以及损伤后引起的瘢痕，会导致机体相关组织或器官生理功能的降低，严重瘢痕甚至可以导致畸形，给患者带来极大的肉体和精神上的折磨，也造成了巨大的经济负担，这也使得皮肤损伤的修复成为科研临床工作者迫切想要解决的问题。近年来随着再生医学的蓬勃发展，干细胞治疗已成为皮肤损伤最具潜力的治疗手段之一。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化潜能、免疫调节及分泌多种生物活性物质的能力等，但是其作用机制和临床疗效还需更深入的论证探究[1]。间充质干细胞来源广泛，存在于体内多种组织中，如骨髓、脐带、羊水、胎盘、脂肪、女性经血及其他组织中。研究结果显示，间充质干细胞可能通过旁分泌外泌体(exosomes)来调控新生血管生成，促进细胞增殖从而起到对皮肤损伤的修复作用。外泌体是干细胞分泌的脂质分子膜包裹的小囊泡[2]，近几年来的研究证实外泌体在皮肤组织损伤修复中起到关键作用。

1 皮肤损伤修复过程

皮肤损伤的修复是一个非常复杂的生物学过程，其修复过程主要包括5个阶段，即：止血期、炎症期、增生期、成熟期和重塑期。整个修复过程需要经过紧密的细胞编排、整合、分化、迁移、增殖、凋亡等一系列过程才能恢复皮肤结构的再生，其中一个重要步骤是重塑期时新生血管的生成，将直接影响修复效果[3]。

近年来细胞凋亡在皮肤损伤修复过程中的作用机制引起了研究人员的极大兴趣，凋亡是由多基因控制的由细胞主动争取的有序变化的死亡过程，细胞在接受凋亡信号后，凋亡调控分子间的相互作用，活化蛋白水解酶，接着进入连续反应过程。当细胞的增殖与凋亡处于一定程度的平衡状态时可以促进皮肤损伤的修复，当这种平衡被打破，便会引起皮肤损伤的异常愈合[4]。

2 间充质干细胞

2.1 间充质干细胞的分类

间充质干细胞属于多能干细胞，间充质干细胞有很多种类，目前能够从骨髓、脂肪、羊水、脐带血等组织中分离提取间充质干细胞。近年来，因其具有多分化潜能、免疫调节和自我复制及多种生物活性物质的分泌能力等特点而逐渐引起人们的关注，可作为理想的种子细胞用于组织器官的损伤修复。

近年来，骨髓间充质干细胞是细胞治疗中最常见的间充质干细胞类型。然而由于操作的侵入性强，提取的产量低，增殖速度慢等缺点限制了其可用性。近年来一种新型的间充质干细胞被发现并分离提取，即经血干细胞[5](menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs)。子宫作为人体中具有超强再生能力的器官，其子宫内膜会在妇女育龄期经过500次左右有规律的脱落和再生。MenSCs即来源于女性月经期间脱落的子宫内膜，它通过月经血排出体外。由于可以无创和安全地从所有育龄妇女中通过采集月经血获得[6]，因此，经血干细胞具有巨大的临床应用前景。

2.2 间充质干细胞临床应用的安全性问题

尽管间充质干细胞移植在皮肤损伤修复领域显示出良好的临床应用前景，但是直接移植间充质干细胞仍然存在一定的风险。在MSCs制备过程中要充分了解供者的年龄、健康状况、既往病史及家族遗传史，明确各项指标是否符合要求，尽量避免MSCs的干扰因素，在制备储存应用过程中需保持无菌环境，排除受者的医源性感染，建立严格的管理规范制度，保护好供者的安全、健康、权益问题[7]。

此外，MSCs表面主要组织相容性复合体抗原表达较弱，不表达HLA-DR等，受者的机体免疫系统不能充分识别这种未分化的细胞，所以当异源的间充质干细胞进入体内时，引起细胞突变，增大了肿瘤的风险[8]。在移植过程中，间充质干细胞如果没有被完全打散，有就堵塞微小血管而导致血管栓塞，从而导致局部组织缺血坏死。

3 外泌体对皮肤损伤修复的机制

研究表明，真正到达损伤部位并增殖分化为特定组织类型细胞的间充质干细胞仅占很小的比例，间充质干细胞进行损伤修复的主要机制是旁分泌作用[9]。外泌体作为一种重要的旁分泌因子，在皮肤损伤修复中起到关键作用。

3.1 外泌体的生物学特性

外泌体是一种脂质分子膜包裹的小囊泡，直径约为70～160 nm。外泌体来源于细胞核内体系统，由多囊泡体内陷腔化形成并通过多囊泡体与细胞膜融合而释放到细胞外环境中。最早于1983年有研究人员[10]发现了外泌体的释放，但直到发现外泌体转运包括microRNAs、功能性蛋白质等生物活性因子才激起了人们的兴趣。自此，对于外泌体研究的兴趣持续增加，研究方向包括了外泌体作为细胞间信号介质、疾病生物标志物，药物转运载体或者治疗的制剂。外泌体包括脂质、膜、胞质蛋白以及microRNA等物质，这些成分使得外泌体成为细胞间通讯的重要途径。外泌体是旁分泌的一个重要组成部分，它提供了一种非传统非接触的长距离细胞间通讯方式。

越来越多的实验证实，间充质干细胞通过旁分泌外泌体，促进表皮细胞的迁移和生长。除此以外，外泌体还具有免疫抑制的功能，能调节免疫细胞中各种炎症因子的分泌如白细胞介素（Interleukin,IL）IL-6/IL-10、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）TNF-α等，而又因其半衰期较长，可考虑作为临床疾病的无创或微创诊断手段，有效减少患者的痛苦[11]。

3.2 外泌体具有促进血管新生的作用

血管再生是间充质干细胞分泌的外泌体促进皮肤损伤修复的主要机制之一。血管再生包括动脉、静脉以及毛细血管的再生，主要是通过促进平滑肌细胞和血管内皮细胞的增殖和迁移来修复已损伤血管的内皮细胞[12]。Zhang等[13]在促进大鼠烫伤创面的愈合的实验中，发现来源于脐带间充质干细胞的外泌体含有丰富的Wnt蛋白，它能活化β-catenin信号通路，促进创伤后血管的重建新生和胶原蛋白合成,从而促进皮肤损伤修复。Zhang等的研究表明，内皮祖细胞来源的外泌体可通过激活Erk1/2信号通路上调成血管基因如VEGFA，Cox-2，FGF2等的表达，增强人微血管内皮细胞的增殖、迁移，促进新生血管形成，提高糖尿病大鼠难愈性皮肤伤口的愈合[14]。Wang等[15]获取的外泌体来源于一种新近发现的间充质干细胞，即女性月经血的经血源性子宫内膜干细胞。通过microRNA芯片筛选后，发现microRNA-21表达最高,microRNA-21作用于靶基因PTEN,并激活下游的PTEN/Akt信号通路，发挥促血管新生和抗心肌细胞凋亡的作用。

3.3 外泌体具有抑制瘢痕形成的作用

皮肤损伤修复过程中的一个重要的细胞是成纤维细胞。在伤口愈合过程中，成纤维细胞有助毛囊的形成，从而降低皮肤愈合过程中瘢痕形成的几率。另一个重要细胞是肌成纤维细胞，它在皮肤损伤修复过程中起到组织收缩的作用。但是在病理情况下，肌成纤维细胞的持续存在会引发皮肤创面过度收缩从而导致増生性瘢痕形成。

Fang等[16]研究表明，脐带间充质干细胞来源的外泌体在小鼠背部皮肤全层创面缺损模型中可通过减少肌成纤维细胞在皮肤损伤后的过度聚集，来抑制瘢痕形成。该课题组通过高通量转录组测序发现外泌体中富含microRNAs，主要成员有miR-23a,miR-21等，通过阻断TGF-β/SMAD2信号通路，减少胶原沉积，抑制肌成纤维细胞的形成，从而起到抑制瘢痕形成的作用。Hu等[17]在皮肤全层损伤模型中发现，脂肪间充质干细胞来源的外泌体能刺激成纤维细胞的增殖、迁移，促进胶原蛋白的合成，增加PCNA，cyclin-1，N-cadherin的表达，从而抑制瘢痕形成、促进皮肤伤口的愈合。

4 外泌体制备过程中的问题

目前学者认为获得外泌体分离的金标准是超高速梯度离心法，但是所获得的外泌体提取量并不充足，且耗时耗力效率低下，不适合大量制备。随着研究工作的深入，紧接着有了外泌体提取盒的出现，外泌体提取盒一方面可以节约培养基另一方面也减少了操作步骤，但是其价格昂贵，未能大量应用于临床。期望在将来的研究中，可以找到外泌体提取盒的平价替代品。