嵌合抗原受体修饰T细胞治疗血液系统恶性肿瘤研究进展

王雪莹，石 琳，程 志

(河南中医药大学第二附属医院血液科，河南 郑州 450002)

嵌合抗原受体修饰T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)疗法属于肿瘤免疫疗法，其通过提高肿瘤细胞的免疫原性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，从而抑制或杀灭肿瘤细胞。2013年《Science》杂志将肿瘤免疫治疗评选为“年度十大科学突破之首”[1]，2015、2016年美国临床肿瘤学会年度进展报告中将肿瘤免疫治疗列为“年度进展”[2-3]。近5 a来，CAR-T疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了突出成绩，对难治复发性急性B淋巴细胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)患者治疗后的完全缓解(complete response,CR)率高达90%[4]，对难治复发性多发性骨髓瘤患者治疗后的总缓解率(overall response rate,ORR)达85%(该数据来源于恒润达生在2018年12月美国ASH年会上发表的报告，试验注册号NCT03093168)。据相关文献报道，截止2018年5月8日，全球已有550项CAR-T临床试验，其中美国212项，中国171项，欧洲89项[5]。但CAR-T治疗后的脱靶效应、肿瘤复发等问题仍制约着其疗效和安全性。本文就嵌合抗原体(chimeric antigen receptor,CAR)的结构演变及CAR-T的抗肿瘤作用机制、在血液系统恶性肿瘤中的应用、目前面临的问题和解决方案等作一综述。

1 CAR的结构演变

CAR由胞外抗原识别结构域、铰链区与跨膜结构域、胞内信号转导结构域3部分组成[6]，其结构演变经历了一个不断改进、不断发展的过程。第1代CAR只有1个胞内信号组分CD3ζ或者FcεRIγ分子[7]，只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，体内存活时间短，抗肿瘤效应弱。第2代CAR在第1代基础上引入1个共刺激分子信号(如CD28、CD4-1BB等)[8-10]，提高了CAR-T的增殖能力和肿瘤细胞杀伤能力，延长了其在体内的存活时间。大量临床试验和动物实验表明，含有CD28共刺激分子的CAR-T可以维持T细胞的扩增[11-12]。第3代CAR是在原有设计上串联2个免疫共激活信号分子(如4-1BB/CD28与CD3ζ结合)[13]。第4代CAR在第3代的基础上增加了编码CAR及其启动子的载体[14]。

2 CAR-T的抗肿瘤作用机制

CAR-T的本质是经过基因工程技术修饰的T细胞，是从患者或供者的外周血中分离出单个核细胞或CD3+T细胞，在体外将针对肿瘤特异性抗原的抗原识别区和胞内信号转导结构域进行基因重组，通过慢病毒载体、睡美人转座子系统、反转录病毒[15-17]等技术转染患者的T细胞，将经过纯化、扩增的CAR-T回输至患者体内，短时间内患者即可获得自体的、可被肿瘤细胞激活的细胞毒性T细胞，其通过释放细胞因子等达到靶向杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长的目的[18]。

正常情况下，T细胞发挥免疫功能受到主要组织相容性复合物( major histocompatibility complex,MHC) 的限制。MHC的限制性是指T细胞抗原受体识别抗原提呈细胞提呈的抗原肽时，必须同时识别抗原肽-MHCⅠ/Ⅱ分子复合物，也称为T细胞的双识别[19]。CAR-T细胞的优势在于它与抗原的结合不依赖于MHC的递呈，而是通过单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)直接结合表面抗原，CAR可以通过CD3ζ和共刺激结构域同时向T细胞传递信号，从而诱导T细胞的激活[20]。这一方式能有效避免因肿瘤细胞MHC表达下调发生的免疫逃逸。此外，每个CAR-T能够杀灭大量肿瘤细胞[21]，并且可以通过抗原释放、协助肿瘤浸润性淋巴细胞攻击肿瘤细胞、延长存续时间这3种方式加强免疫监视，预防肿瘤复发[22-23]。

3 CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤中的应用

3.1CAR-T疗法在急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)中的应用ALL是一种起源于单个B或T淋巴细胞前体细胞的恶性肿瘤，好发于儿童，中位发病年龄为13岁。而成人急性白血病中ALL仅占20%。随着化学治疗方案的不断优化，现阶段儿童ALL的CR率可达98%，5 a 无病生存 (disease free survival，DFS)率达80%以上。成人ALL的CR率也可达80%以上[24]，但其长期生存率较低；儿童患者缓解后易复发，导致其病死率仍较高。

在难治复发性B-ALL的治疗中，应用最多、疗效最好的是靶向CD19的CAR-T。CD19是B细胞表面膜蛋白，广泛表达于各个分化阶段的B细胞(正常B细胞及B细胞恶性肿瘤细胞)表面，是B细胞肿瘤的理想靶点[25-26]。据相关文献报道，目前已有350例难治复发性B-ALL患者在不同中心、不同国家参与回输不同结构CAR-T的临床试验[27]，CR率可达50%～90%[4]。2016年，美国国家癌症研究所利用反转录病毒转染以CD28为共刺激因子、以FMC63为scFv的CD19-CAR-T治疗5例异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后复发的成人B-ALL患者，CR率达90%(4/5)，CR患者的微小残留病变(minimal residual disease,MRD)均为阴性[27]。MAUDE等[28]给予75例儿童和年轻成人B-ALL患者输注Kymriah(诺华批准上市的CAR-T产品)进行治疗，结果发现，75例患者治疗后6个月的无事件生存率和总生存率分别为73%和90%，治疗后12个月的无事件生存率和总生存率分别为50%和76%。CHENG等[29]采用第2代CD19-CAR-T治疗7例难治复发性B细胞白血病患者，其中5例(71%)达CR，2例中枢神经系统白血病(central nervous system leukemia，CNSL)患者表现出持久的CR，持续时间>15个月。

3.2CAR-T疗法在B细胞淋巴瘤中的应用淋巴瘤是一种异质性很强的恶性肿瘤，病理类型十分复杂，疾病转归差异极大，目前已知的淋巴瘤有近70种病理类型。淋巴瘤在我国恶性肿瘤中发病率居第8位。根据国家癌症中心2015年数据，我国每年新增淋巴瘤患者8.8万人，每年病死人数6.8万人，其中弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)约占45%[30]。

目前，淋巴瘤的治疗仍以化学治疗、放射治疗和生物免疫治疗的综合治疗方式为主，必要时可行造血干细胞移植。除少数局限期惰性非霍奇金淋巴瘤可采用局部放射治疗外，多数患者应以联合化学治疗为主。近年来，以利妥昔单抗(抗CD20单克隆抗体)为代表的免疫治疗在B细胞淋巴瘤中获得突破性进展。CAR-T疗法在治疗B细胞淋巴瘤方面也取得了较好疗效。2017年10月，美国食品药品监督管理局批准Kite Pharma公司生产的Yescarta用于治疗经其他方法治疗后无效或既往至少接受过2种方案治疗后复发的特定类型的成人B细胞淋巴瘤，包括DLBCL、转化型滤泡性淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤。

3.3CAR-T疗法在多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)中的应用MM是浆细胞恶性增殖性疾病，由于存在微小残留病变，在治疗过程中无论MM达到何种程度的缓解，最终均会复发。MM是近2 a CAR-T治疗的新热点，常用的靶点有CD138、CD19、B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)等。

BCMA又称CD269，属于肿瘤坏死因子超家族，常表达于MM细胞、正常浆细胞及部分B细胞，免疫组织化学染色显示BCMA在MM细胞上均匀表达[31]。ALI等[32]采用BCMA-CAR-T治疗12例骨髓瘤患者，所有患者在接受该治疗前至少接受了3个疗程的化学治疗，结果显示，1例患者获得严格意义的完全缓解，持续17周后复发，2例患者达到非常好的部分缓解，1例患者达到部分缓解，其余患者均病情稳定。河南省中医院应用BCMA-CAR-T治疗11例难治复发性MM，其ORR达90.91%。

4 CAR-T疗法面临的问题及应对策略

4.1CAR-T治疗血液系统恶性肿瘤的不良反应及应对策略

4.1.1细胞因子释放综合征(cytokinereleasesyndrome，CRS) CRS是由于CAR-T输入体内后，scFv的特异性抗体识别并结合肿瘤抗原，激活T细胞，导致大量炎性因子释放，同时招募和激活体内其他炎性细胞因子，引发全身炎症反应综合征，是CAR-T回输后最常见的不良反应，也被认为是CAR-T疗法在体内“发挥作用”的标志，但严重的CRS可导致患者死亡。大多数患者出现的轻度CRS可通过标准辅助治疗，如类固醇、白细胞介素-6受体拮抗剂妥珠单抗来控制[33-34]。CAR-T回输前的预处理化学治疗能降低患者的肿瘤负荷，也能在一定程度上降低CRS反应[34-35]。

4.1.2神经毒性CAR-T回输后的神经毒性主要包括意识混乱、失语症、反应迟钝、肌阵挛、癫痫等，在大多数患者中是可逆的，但严重时可引起脑水肿，导致患者死亡。2017年3月，Juno公司因临床试验中出现多例脑水肿患者死亡而正式宣布放弃CAR-T产品JCAR015的Ⅱ期临床试验。但目前在河南中医药大学血液科参与CAR-T临床试验的近70例患者中，尚未观察到明显的神经系统毒性。

鉴于CAR-T不良反应的不可预知性，已有研究尝试在CAR-T中加入“自杀基因”或“分子开关”来实现细胞的可控凋亡。2018年第54届美国临床肿瘤学会年会中，上海恒润达生生物科技有限公司(自2015年起与河南中医药大学血液科合作开展CAR-T疗法临床试验研究)受邀汇报2项最新临床项目进展，其中之一就是带有安全开关的以BCMA为靶点治疗MM的CAR-T。该公司开发的是通过γ-反转录病毒介导的活化T细胞转导，以表达具有4-1BB共刺激结构域的第2代CAR，以及截短的表皮生长因子受体作为安全开关的抗BCMA-CAR-T产品。

4.1.3脱靶效应理想状态下的靶点抗原是仅表达于肿瘤细胞，而正常细胞及CD34+细胞不表达。但实际上很多CAR-T的靶点在正常组织细胞上也有表达，这就导致正常细胞也会受到CAR-T的攻击而受损伤。为了提高CAR-T的特异性，除了寻找更理想、特异性更高的靶点外，科学家们也在不断进行新的尝试。如不断改进CAR-T的结构以提高其作用的精准性和安全性。改进CAR-T结构的方法主要有以下几种:(1)串联型CAR-T。例如CD19和CD22，制备2个CAR用1个T细胞来表达。但CD19和CD22的串联顺序会影响CAR-T的杀伤能力，其疗效反而不如CD19-CAR-T[36]。(2)抑制性CAR-T(inhibitory CAR,iCAR)。可使用识别肿瘤相关抗原的胞外结构域构建CAR，使用识别正常细胞抗原的胞外结构域构建iCAR，以降低脱靶效应。(3)组合抗原。WILKIE等[37]将2个识别不同抗原的CAR表达于细胞表面，每个CAR结构都是不完整的，只有当2个抗原同时被识别后才能激活细胞内启动原件。

4.1.4B细胞再生障碍ALI等[32]研究发现了1例MM患者在输注CAR-T后出现正常浆细胞缺乏。该研究表明，在某些情况下，免疫球蛋白替代疗法(如输注丙种球蛋白)应该用于接受抗BCMA-CAR-T治疗的患者。

4.2CAR-T治疗血液系统恶性肿瘤后复发的应对策略

4.2.1增强CAR-T杀伤力，避免免疫逃逸研究人员研制出一种新型CAR-T，能同时表达促炎性因子及细胞因子受体，使CAR-T细胞既能调节肿瘤微环境中的免疫抑制信号，又能通过细胞因子受体的激活而促进CAR-T增殖，这种类型的CAR-T也称为“装甲车”。2018年8月，纪念斯隆凯特琳癌症中心的科学家LIU等[38]将CAR-T和免疫检查点抑制剂这2种最具潜力的免疫疗法结合在一起，研究出了一种新型CAR-T，其能够有效对抗实体肿瘤。这种CAR-T能分泌一种迷你版本的免疫检查点阻断抗体，该抗体可发挥类似程序性细胞死亡受体-1(programmed cell death 1，PD-1)抗体药物的作用。这种构想也可以应用于血液系统恶性肿瘤的治疗。

除了直接让CAR-T分泌免疫检查点阻断抗体，还可以将CAR-T治疗与口服免疫检查点抑制剂联合起来。免疫检查点是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。正常情况下，免疫检查点的调节功能可使机体免受自身免疫攻击及炎症损害。细胞恶变后可通过上调免疫检查点的表达，抑制T细胞的杀伤功能，从而逃脱免疫监视。免疫检查点疗法是通过阻断被癌细胞激活的免疫抑制通路，从而提高T细胞抗肿瘤的免疫应答。近年来，免疫检查点抑制剂迅速发展，其中最有名的是2018年在中国上市的PD-1抑制剂纳武利尤单抗和帕博利珠单抗。CHONG等[39]报道了1例难治性DLBCL患者经CD19-CAR-T治疗无效后加用帕博利珠单抗进行治疗，该患者疗效评价为疾病缓解(response disease，RD)，并观察到加用帕博利珠单抗后CD19-CAR-T的增殖活性得到了大幅度提高。

此外，有研究发现，经过反复多次化学治疗后T细胞的活性下降，寻找标志物来筛选出活性较强的T细胞有可能会提高CAR-T的杀伤力[40-41]。

4.2.2克服高危基因突变在血液系统恶性肿瘤中存在遗传学或分子生物学方面的不良预后因素，有些具有相对特异性，比如t(4；14)对于MM是不良预后因素，但对于白血病并非如此；有些具有共性，比如TP53基因突变和复杂染色体核型在任何一种肿瘤中都是不良预后因素。临床中一些药物也是通过干预基因突变或融合基因达到控制甚至治愈疾病的目的。95%的慢性粒细胞白血病患者存在Ph染色体阳性，Ph染色体指22号染色体长臂与9号染色体发生易位形成的新染色体，即t(9；22)(q34；q11)。酪氨酸激酶抑制剂的问世使慢性髓样白血病和ALL患者10 a总体生存率达80%以上[42-44]。经聚合酶链反应检测发现，使用该药治疗的慢性粒细胞白血病患者的骨髓或外周血中融合基因多数可达到完全分子学缓解。治疗MM的新药硼替佐米和来那度胺可以克服t(4；14)带来的不良预后，使患者获益。从这些获得确切效果的药物中，或许能得到一些启发：能否研制一些新型药物来纠正染色体或基因突变，以此来预防疾病复发、改善肿瘤类疾病的不良预后？

4.2.3中医药预防CAR-T回输后的复发中医学认为，肿瘤的发生与体内邪气炽盛产生“邪毒”以及正气虚弱无力抗邪有关，正如《内经·素问》中所说：“邪之所凑，其气必虚”。中医对于肿瘤多采取攻邪、扶正或攻补兼施的治疗方法。扶正即通过补气、养血、温阳、滋阴等方法提高人体的抗邪能力，预防疾病发生或促进疾病痊愈。对于CAR-T治疗后的肿瘤复发，中医可着眼于提高T细胞活力、延长T细胞在体内的存续时间。目前，尚未见相关的临床研究报道，其临床疗效及具体作用机制有待进一步研究。

除此之外，CAR-T疗法也可作为难治复发性ALL造血干细胞移植前的桥接治疗。对于反复进行化学治疗不缓解的患者，CAR-T回输后能很快获得CR(骨髓象及MRD均转为阴性)，从而为造血干细胞移植创造机会。CAR-T回输后的巩固维持治疗是给予小剂量化学治疗还是其他疗法，目前尚有待继续研究。

CAR-T疗法在血液系统肿瘤取得的疗效让人振奋，但仍有很多问题需要解决。CAR-T疗法是否有一些远期的不良反应？患者在接受CAR-T治疗达到CR(或MM达到PR以上疗效)后是否有必要继续化学治疗或口服新药巩固治疗？这些问题都需要通过长期临床观察来验证。