毛细胞白血病相关生物学标记研究进展

张海英综述，白 海审校

(联勤保障部队第九四○医院血液科/全军血液病中心，兰州 730050)

毛细胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)是一种少见类型的白血病，病情进展缓慢，世界卫生组织(WHO)分类归于B淋巴细胞的恶性肿瘤，亚洲人发病率明显低于欧美人，国外其发病占白血病的2%～3%，国内占0.58%[1-2]。目前病因仍不清楚，有研究报道与自身免疫疾病有一定关系，如血管炎(特别是动脉炎结节)，另外许多病例的发生呈现家族相关性，但具体原因不明[3]。近年来，分子和细胞遗传学的发展对HCL的诊断、治疗和预后的评判起到巨大的推动作用。研究发现一些重要的预后指标，如BRAF基因和免疫球蛋白重链可变区基因的突变状况及CD38的过度表达、染色体畸变等，有助于判断HCL的预后。为此，本文将对这些指标进行综述，以期指导HCL的预后判断和治疗。

1 HCL的免疫学标记

目前WHO将HCL分为两种临床类型:经典型HCL(classic hairy cell leukemia，HCLc)和变异型HCL(hairy cell leukemia variant,HCLv)。毛细胞具有成熟B淋巴细胞的免疫表型，表达 CD19、CD20、CD22、CD79a、SmIg，不表达CD21、CD23、CD79b，特异性高表达CD25、CD103和CD11c[4]。CD103对HCL有很高的敏感性和特异性，如果与其他全B淋巴细胞标志共表达，强烈提示HCL。HCLv除表达成熟B淋巴细胞免疫标志CDl9、CD20、CD22和FMC-7外，还表达CDllc，其中26%弱表达CD10，5%弱表达CD5，不表达CD25、CD103[5]。故强表达CD25、CD11c和CD103，再结合典型的形态学特征是鉴别HCLc与其他B系白血病的标志。

CD38是与白细胞活化相关的抗原，是促使B淋巴细胞活化和增殖的Ⅱ类跨膜糖蛋白。CD38可以提高HCL细胞的生存率，促进其增殖。HCL患者细胞内信号转导分子RhoH低表达，在小鼠模型中RhoH的上调可以抑制HCL的发生，CD38被证实是依赖于RhoH低表达的蛋白[6]。PORET等[7]研究发现，51例HCL患者中18例为CD38阳性，敲除CD38基因可以增加肿瘤细胞凋亡，持续性抑制内皮细胞，提高机体抗肿瘤能力。因此，CD38可能是预防和治疗HCL的新靶点。

CORTAZAR等[8]对500例具有特异性抗膜联蛋白A1(ANXA1)抗体的B淋巴细胞肿瘤患者的肿瘤细胞进行免疫染色，结果表明HCLc中存在ANXA1特异性表达，而在HCLv和其他类型B淋巴细胞肿瘤中均不表达。因此，ANXA1可作为鉴别HCLc和其他类型B淋巴细胞肿瘤及HCLv的新指标。有研究认为，ANXA1可能是糖皮质激素在炎性反应中的一种中间产物，其表达与肿瘤细胞吞噬细菌和乳胶颗粒有关。ANXA1的免疫细胞化学检测将会成为HCL诊断的重要依据[9-10]。

2 HCL的分子生物学标记

2.1BRAF基因V600E突变 近年来研究发现，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在HCL发生、发展过程中起重要作用，而BRAF基因编码的丝/苏氨酸蛋白激酶(BRAF蛋白)正是该通路的重要转导因子[11]。BRAF基因突变可引起上述通路持续失控的激活，导致细胞的过度增殖、分化及肿瘤形成。因此，BRAF基因在HCL中的作用日益受到关注，其生物学行为及其临床意义成为近年来的研究热点[12]。

TIACCI等[13]采用全外显子组测序的方法，对47例HCL患者的样品进行测序，发现所有样品均存在BRAF V600E突变。而该研究检测的195例患有其他外周B淋巴细胞肿瘤或白血病的患者均不携带BRAF V600E突变，包括38例脾边缘带淋巴瘤及分类不明的脾淋巴瘤或白血病的患者。ITAMURA等[14]也在所有受检的经典HCL样本中检测到BRAF V600E突变，同时，他们还在伴有免疫学变化(CD25-、CD10+、CD123-)的形态学经典HCL患者中观察到BRAF V600E突变。另外，还有研究发现BRAF突变存在于HCL患者的造血干细胞中[15]。此外，BRAF V600E突变在整个疾病过程中都非常稳定，包括在初诊后甚至数十年后多次复发。这些发现均证实BRAF V600E突变是HCL的分子标志。HCLv和HCLc的IGHV4-34突变型中是不存在BRAF V600E突变的[16]，而在BRAF V600E突变阴性的HCL患者中检测到11号外显子的两个新突变，提示可以在V600E阴性的病例中筛选11号外显子[17]。这一发现或对HCL的发病机理、诊断及靶向治疗研究具有启发意义。

鉴于RAS和BRAF在恶性肿瘤发展中的重要性，已经研制了针对BRAF的抑制剂。在体外研究中，证明BRAF抑制剂可以促进HCL细胞凋亡[18]。DIETRICH等[19]在难治性HCL患者中使用威罗菲尼，主要结合BRAF分子并抑制丝裂原激活蛋白激酶(MEK)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化和细胞增殖，证实了突变型BRAF可作为HCL的治疗靶标。

2.2微小RNA 微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类大小为20～25个核苷酸的非编码小RNA。近年研究表明，miRNAs与肿瘤的发生、发展关系密切，某些miRNAs在肿瘤中呈特异性表达[20-21]。BRAF突变可能导致几种对致癌基因具有调控作用的miRNAs表达的改变，近年来，miRNAs和BRAF突变与包括乳头状甲状腺癌在内的肿瘤之间的关系已经得到确定[22]。KITAGAWA等[23]研究发现，相对于正常或其他的恶性B淋巴细胞，HCL中miRNA-221/-222家族、-22、-24、27a和Let-7b均高表达。他们还发现HCL中miRNA-221/-222过表达可导致细胞周期依赖性激酶阻滞基因1B(CDKN1B，又称p27/Kip1)表达水平降低，后者是这些miRNAs的直接靶蛋白。鉴于BRAF突变与PTC中miRNA-221/-222的关系，HCL中miRNA-221/-222的过表达调控HCL的MAPK信号通路，并且与BRAF突变有关[24]。在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中，miR-22可诱导细胞增殖，并可上调Cyclin D2 (CCND2)和MAPK1基因的水平[25]。因此，作者认为miRNA-22可能对HCL中MAPK信号通路具有调控作用，miRNAs与HCL的疾病进展和预后有关，对HCL特异性miRNAs及其与MAPK信号通路关系的研究对于HCL的发病机制、诊断和靶向治疗具有启示作用。

2.3CDKN1B基因 CDKN1B基因是调控细胞周期的相关基因。在细胞周期中，通过与cyclin-cdk复合物结合抑制Rb蛋白磷酸化，从而阻止细胞从G1期进入S期，导致细胞周期阻滞，因而被认为是抑癌基因[26]。

国外研究提示在多种人类肿瘤中发现了p27的低水平表达，包括口腔鳞癌、乳腺癌、前列腺癌等。p27/Kip1低表达与人类肿瘤治疗效果差、侵袭、恶性预后、肿瘤分级及进展都有关系。最新研究表明，CDKN1B基因也可在其他恶性血液病的发病机制中发挥作用，包括T幼稚淋巴细胞白血病(T-PLL)、急性髓细胞白血病(AML)和淋巴瘤等[27-28]。

DIETRICH等[29]采用全外显子测序的方法对81例HCL患者进行测序，发现13例患者存在突变，并且其中11例是克隆性突变，提示CDKN1B基因突变在HCL的生物学和发病机制中发挥重要作用。在HCL中，所有患者p27蛋白表达缺失或减弱，提示了基因突变以外CDKN1B基因沉默的其他机制。因此，通过基因突变或由BRAF-MEK-ERK信号转导通路本身诱导p27蛋白活性下调，可促进BRAF突变驱动的HCL克隆扩增。而在白血病及其他恶性肿瘤中，CDKN1B基因突变是很罕见的，并且与BRAF V600E不共存。

2.4免疫球蛋白重链可变区(IGHV)基因突变 研究发现，90%左右的HCL B淋巴细胞存在IGH突变。IGHV突变情况对HCL的预后具有重要的意义。基于IGHV突变情况，HCL患者的预后可分为两个亚型:突变型HCL(>2%突变)和野生型HCL(≤2%突变)。野生型HCL患者的总生存时间(OS)少于突变型HCL[30]。

据报道，HCLc及HCLv患者表达IGHV4-34时的预后特别差[31]。82例患者中，IGHV4-34(+)和IGHV4-34(-)患者的OS分别为4.8年和26年(P<0.000 1)。当诊断为HCLc时，IGHV4-34仍有重要作用，14例IGHV4-34(+)和68例IGHV4-34(-)患者的OS分别为4.7年和27.0年(P<0.000 1)。当排除IGHV4-34(+)患者后，HCLc和HCLv患者的OS无明显差异。多数患者IGHV基因体细胞高突变，IGHV4-34(+)患者对嘌呤类似物单药治疗原发耐药且疾病进展迅速，是HCL的预后不良的标志。

2.5特异的染色体 复发性染色体异位在HCL几乎不存在。有几项研究利用阵列比较基因组杂交技术检测HCL患者的染色体畸形状况[32-33]。研究发现，大约1/3的受试患者存在染色体变异，如5号染色体三体、7q22-q35缺失、5q13.31重复等。因此，HCL患者的基因通常是稳定的。相反，HCLv患者存在17p缺失[33]。

2.6其他生物学标记 除了Raf-MEK/ERK通路活性，其他信号途径如磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(P13K/AKT)途径的激活可以促进HCL细胞发育。HCL B淋巴细胞膜表面过表达CD123(IL-3Ra)或CD135(FLT3)，这些途径的激活可以反过来激活P13K/AKT途径，从而使HCL B淋巴细胞产生抗凋亡作用[34]。LAKIOTAKI等[35]发现，AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活化可促进HCL细胞增殖，BRAF V600E突变体的高表达可提高磷酸化mTOR(p-mTOR)的表达水平，并且p-AKT/p-mTOR过表达是早期复发的不利因素，提示AKT的激活可为HCL的治疗提供新的依据。

近期研究发现，31%的脾边缘区淋巴瘤(SMZL)和26%的弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)存在KLF2基因突变或缺失，在24例HCL患者中，也有4例患者检测到KLF2突变，而在其他淋巴样肿瘤(包括淋巴结和结外边缘区淋巴瘤)中频率较低。KLF2是一种转录因子，可以调控多个成熟B淋巴细胞亚群的体内分化。HCL中的KLF2突变可导致氨基酸替代，而在其他肿瘤中还可导致明显的破坏性变异(即无义突变、移码突变或涉及保守剪接位点的突变)[36]。值得注意的是，CDKN1A/p21(一种促进衰老的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)可以成为KLF2转录因子的直接靶点[37]。无论是克隆表达还是在HCL中特异性发现的错义突变的体细胞状态尚不清楚，因此需要进一步研究以更好地阐明KLF2突变在HCL发病机制中的作用。

另外，有报道称MAP2K1存在于HCL亚型的患者中。6/15的IGHV4-34(-)HCLv患者、4/9的IGHV4-34(+)HCLv患者和5/7的IGHV4-34(+)HCLc患者均存在MAP2K1突变[38]。MAP2K1编码丝裂原活化蛋白激酶激酶1，是MAPK信号转导通路的组成部分。作者在HCLv和IGHV4-34(+)HCL细胞中编码N-末端自动调节结构域的第2和第3外显子均发现体细胞突变。最近DURHAM等[33]对HCL进行了深度靶向突变和拷贝数分析，研究发现，除BRAF V600E之外，HCLc中最常见的遗传改变是染色体7q的杂合缺失，分别在15%和25%的HCLc和HCLv中鉴定出KMT2C(MLL3)突变。此外，在13%的HCLv中鉴定出剪接因子U2AF1的功能性突变。

3 小 结

HCL是一种较少见的B淋巴细胞恶性增生性血液系统肿瘤，占白血病的2%～3%。CD38是一种促使B淋巴细胞活化和增殖的Ⅱ类跨膜糖蛋白，可能是预防和治疗HCL的新靶点。BRAF V600E突变是HCL患者最重要的标记，BRAF突变可能引起miRNA表达的改变，而HCL中miRNA-221/-222过表达可导致CDKN1B(p27/Kip1)表达水平降低。BRAF和MEK抑制剂的研究进展提供了治疗靶标，而对其他生物学标记的深入研究也将为HCL患者的诊断和治疗带来巨大变化。