心磷脂对细胞凋亡作用的研究进展

张玉姣,张 晶

(新乡医学院心理学院,中国河南新乡453003)

心磷脂是一种线粒体特异的磷脂,其在线粒体依赖的细胞凋亡过程中起着十分关键的作用,并且伴随着细胞凋亡过程的进行,心磷脂本身也发生着一些相应的变化。本文就心磷脂在细胞凋亡过程中的重要作用及其在癌症中的研究进展予以综述。

1 心磷脂概述

1.1 心磷脂的结构及分布

心磷脂是线粒体特异的一类磷脂,因其首次是从心脏中被分离出来的,故名心磷脂[1]。心磷脂又称双磷脂酰甘油,是由两个磷酸分子和3个甘油分子构成骨架结构,再与4个脂肪酸分子相连接组成。因其磷酸分子在生理pH条件下会被去质子化,所以心磷脂通常带负电荷。心磷脂主要位于线粒体内膜,大约占总磷脂含量的25%；而线粒体内膜上的心磷脂大约65%分布在内小叶,其余在外小叶。心磷脂在线粒体的外膜也有大约4%的分布,特别是靠近内、外膜间的接触部位。在内外膜的接触部位,心磷脂可以到达线粒体外膜和线粒体靠细胞质的表面。内外膜接触部位的形成是因为心磷脂可以和另外一种带负电荷的磷脂分子,即磷脂酰乙醇氨(phosphatidylethanolamine,PE),形成一种非脂双层的六角形HII相结构,这种结构有利于内外膜的融合[2]。

1.2 心磷脂的生物学功能

心磷脂主要分布于线粒体内膜,是维持线粒体结构的重要组成部分。因为心磷脂在脂双层膜中可以产生负曲率弹性应力,所以其对线粒体内膜嵴保持一定的弯曲度起着关键的作用[3]。此外,心磷脂可以和位于线粒体内膜上的蛋白质(比如细胞色素c)结合,维持线粒体内膜的稳定。研究者直接将心磷脂合成酶基因的干扰RNA转入HeLa细胞,发现心磷脂的缺乏导致大量游离细胞色素c在膜间隙堆积,使线粒体表现出嵴重组的征象[4]。另有研究证实,心磷脂缺乏可以破坏ATP合成酶的低聚化组装,这将直接影响线粒体内膜嵴结构的形成[5]。综上所述,心磷脂在维持线粒体正常结构中是必不可少的。

心磷脂也能和电子传递链中的复合体相互作用。心磷脂就像胶水,紧紧地将电子传递链中的氧化磷酸化复合体连在一起[6～7]。例如:复合体Ⅲ和复合体Ⅳ可以形成一个超级复合体,进而使质子和电子转运产生ATP。这种超级复合体的形成离不开心磷脂的存在。在酵母心磷脂合成酶基因crd1缺陷株中,人们发现约90%的复合体Ⅲ和复合体Ⅳ表达为独立的同型二聚体,而在crd1野生型的细胞中则可发现存在二者的超级复合体[6]。以上信息说明心磷脂对电子传递复合体的有序组织起了关键的作用。

2 心磷脂在细胞凋亡过程中的重新分布

2.1 心磷脂向线粒体内膜外小叶转移

如上所述,正常情况下心磷脂主要位于线粒体内膜,而且主要位于线粒体内膜的内小叶。但是有研究发现,在细胞凋亡早期,心磷脂在线粒体内膜外小叶的含量增加[8]。用凋亡刺激剂星形孢菌素(staurosporine,STS)孵育人早幼粒细胞白血病HL-60细胞1.5 h,结果显示处理组外小叶心磷脂的含量大约是未处理细胞的3倍；用肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)处理人单核细胞白血病U937细胞1.5 h,结果同样显示处理组细胞外小叶心磷脂的含量大约是未处理细胞的2倍[9]。这些研究表明,在细胞凋亡早期,心磷脂在线粒体内重新分布,即在内膜内、外小叶中发生了迁移。这一过程的发生先于一些凋亡标记的出现,比如磷脂酰丝氨酸外翻、DNA降解以及膜电位的变化等,但是出现在活性氧自由基的释放之后[9]。此外,因为细胞色素c可以与心磷脂在外小叶发生结合[10],所以凋亡早期心磷脂向线粒体内膜外小叶的迁移可以促进二者的结合,并使细胞色素c产生过氧化物酶活性,进而促发下一步凋亡过程。

2.2 心磷脂在细胞质膜出现

心磷脂是线粒体特异的磷脂,一般不存在于细胞其他质膜结构中。许多研究表明,在细胞凋亡过程中,会在质膜上发现心磷脂的存在[11～12]。Sorice等[11]报道,对U937细胞进行促凋亡处理后,分别利用NAO(10-N-nonyl-acridine orange)染色和抗心磷脂抗体孵育,可在共聚焦显微镜下观察到质膜上或质膜周围有明显的心磷脂出现,且这种现象一般出现在凋亡早期。据推测,质膜上心磷脂的出现,可能引起机体产生抗心磷脂抗体,进而可能引发一些自身免疫疾病,比如获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)等[11,13]。

2.3 心磷脂的降解及再循环

心磷脂在细胞发生凋亡时,不仅会在分布上发生变化,同时也伴随着含量的一些改变。人们在动物研究中发现,一些与凋亡有关的病理状态,比如衰老及缺血再灌注,都伴有心磷脂含量的减少[14～15]。

Kirkland等[16]在细胞水平的研究也证实了这一点。他们对培养的大鼠交感神经元细胞进行凋亡诱导,即对细胞进行不加神经生长因子处理,在一定时间之后,发现线粒体内心磷脂含量明显降低；有些细胞内的心磷脂甚至完全丢失。此外,Buratta等[17]在棕榈酸诱导的胶质母细胞瘤GL15细胞中也发现了心磷脂含量的降低。在细胞凋亡时,心磷脂含量的降低可能有两方面的原因:一是合成的减少[18]；另一种就是心磷脂的降解。

心磷脂的降解是在磷脂酶的作用下发生的,之后会产生溶血心磷脂(LysoCL),比如单溶血心磷脂(MLCL)、双溶血心磷脂(DLCL)等。溶血心磷脂可能会进入心磷脂的重塑,即参与心磷脂的代谢循环[19]。这一过程需要促凋亡蛋白tBid(truncated Bid,由Bid切割而来)的参与。tBid除了可以诱导线粒体形成孔状结构外,还具有脂转移活性[20],可以将线粒体上降解的心磷脂即溶血心磷脂转移到内质网上,然后在酰基转移酶的作用下将溶血心磷脂重新合成新的心磷脂。新合成的心磷脂一方面可能通过促凋亡蛋白Bid(BH3 interacting domain death agonist)或其他脂类转移蛋白质运回线粒体；另一方面也可能被一些脂蛋白包装,随后通过胞吐作用被转运出去。这在一定程度上解释了凋亡过程发生时心磷脂含量减少及在细胞表面发现心磷脂的原因。其实,凋亡刺激可以加速心磷脂的代谢循环,一方面可以使心磷脂合成的前体物质磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)累积；另一方面可以加速心磷脂的降解。据此推测,一些抗凋亡蛋白(例如Bcl-2)可能通过抑制心磷脂的降解减慢其代谢循环；一些胱天蛋白酶(caspase)激活剂可以加速心磷脂的代谢循环,例如:凋亡刺激后caspase可通过切割Bid产生tBid,从而加速心磷脂的转运等[19]。

综上所述,在正常状态下,线粒体心磷脂是相对稳定存在的；但当细胞遇到凋亡刺激时,心磷脂会发生分布的转移、含量的减少或者代谢再循环,这表明凋亡刺激对心磷脂产生了重要的影响,同时也意味着心磷脂参与了凋亡过程的发生。

3 在细胞凋亡过程中与心磷脂共同发挥作用的关键蛋白质

心磷脂作为一个线粒体信号平台,可以启发凋亡[21～22]。在细胞凋亡发生时,心磷脂作为一个信号整合体,可以对细胞色素c、caspase-8和Bid发挥重要的协调作用。

3.1 心磷脂与细胞色素c

细胞色素c可以将电子从复合体Ⅲ传递到复合体Ⅳ,在电子传递链的氧化磷酸化过程中发挥着举足轻重的作用。在细胞收到凋亡信号时,细胞色素c从线粒体中被释放到细胞质,并在细胞质中有效地诱导caspase级联反应,进而引发细胞凋亡。在正常细胞中,线粒体内约85%的细胞色素c分布在内膜嵴,其余细胞色素c则位于内外膜的腔隙中。在细胞发生凋亡时,总心磷脂含量减少或心磷脂不饱和酰基链的氧化导致膜结合细胞色素c的水平下降[18,23～24]。研究报道,使用抗氧化剂[25]或者过表达氧化还原剂[26～27]会阻碍细胞色素c从线粒体的解离；而心磷脂的氧化包含活性氧自由基的产生,所以该过程会促进细胞色素c的释放。

细胞色素c若要从线粒体中释放,首先需要与心磷脂解离。这就涉及到细胞色素c产生的过氧化物酶活性。研究报道,细胞色素c一旦与心磷脂结合,则会产生显著的过氧化物酶活性[10]。心磷脂通过疏水作用破坏细胞色素c的三级结构,从而激活细胞色素c的过氧化物酶活性[28～29]。细胞色素c在与心磷脂结合的状态下,采用非天然构象,可明显地增大血红素缝隙区,从而创造出一个“通道”,使过氧化氢(H2O2)易于接近血红素的结合位点[28],这样细胞色素c就具有了过氧化物酶活性。综上可知,细胞色素c/心磷脂复合体就相当于心磷脂特异的过氧化物酶,在H2O2的作用下,可产生过氧化心磷脂。该过程依赖于可利用的H2O2含量。细胞色素c和过氧化心磷脂的亲和性较低。所以,心磷脂氧化之后,可促进细胞色素c的解离。研究报道,利用放线菌素D处理小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs),可引起促凋亡蛋白Bax(Bcl-2 associated X)易位到线粒体,从而促进超氧化物的产生和心磷脂的氧化；但是,由鱼藤酮或者琥珀酸引起的超氧化自由基的产生并不足以引起细胞色素c产生过氧化物酶活性并释放到线粒体中[30]。这些结果表明,Bax等一些促凋亡蛋白的激活是心磷脂氧化并引起细胞色素c释放的前提条件[31]。

另一方面,在细胞发生凋亡时细胞色素c只有释放到细胞质中才能发挥作用。因此,细胞色素c从心磷脂解离下来后还需要进一步的转运才能诱导下一步的凋亡。研究认为,细胞色素c向胞质中转运有两种与心磷脂相关的可能途径:第一条途径是通过过氧化心磷脂诱导线粒体内、外膜间的蛋白质通道复合体(即线粒体通透性转换孔)开放[32],第二条途径是通过心磷脂招募Bcl-2家族蛋白在线粒体外膜形成孔状结构[33]。相关研究在培养的线粒体中加入过氧化心磷脂,发现线粒体的膜通透性增加,同时细胞色素c释放,而这些均可以被线粒体通透性转换孔形成抑制剂环孢菌素A或米酵菌酸所抑制,表明过氧化心磷脂是线粒体通透性转换孔的诱导因子[32]。Bcl-2蛋白家族是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质,其可以在线粒体外膜上形成超分子孔道,这一过程依赖于心磷脂的存在[33]。但是也有研究表明,心磷脂与Bcl-2家族蛋白形成孔状结构的过程无关[34]。因此,在凋亡过程中细胞色素c的转运机制尚需要进一步的研究。

以上信息表明凋亡过程发生时,心磷脂与细胞色素c先后经历了过氧化物酶形成、过氧化以及解离、释放等过程,在这些过程中心磷脂发挥了重要的作用。

3.2 心磷脂与Bid蛋白

在正常细胞中,Bid位于细胞质。当细胞表面的凋亡受体被活化后,活化的caspase-8切割Bid,产生一个15 kD的C端肽段(tBid)和一个13 kD的N端肽段,tBid肽段在其N端被豆蔻酰化修饰后,便可转位到线粒体上,与促凋亡蛋白Bax或Bak连接,并使它们别构激活,进而使其发生同源寡聚化,在线粒体膜上形成孔状结构,引起细胞色素c的释放[35～36]。免疫电镜观察表明,tBid首先与转位于线粒体外膜的心磷脂结合,然后再招募线粒体蛋白质Bax或Bak的聚集[37～39]。已有研究报道,对于心磷脂缺陷的细胞,tBid结合到线粒体上的能力显著降低[37]。然而,对于来自巴特综合征(Barth syndrome)患者的淋巴母细胞的线粒体,尽管其缺乏酰基转移酶tafazzin并因此缺少成熟的心磷脂,但是却可以成功绑定tBid[40]。有意思的是,巴特综合征淋巴母细胞中的单溶血心磷脂水平增多,推测单溶血心磷脂可以有效诱导tBid转位于线粒体外膜。tBid与线粒体外膜之所以能够相互作用,一种原因可能是心磷脂的负电性与tBid的螺旋发生静电作用,但也有可能是由于tBid直接插入脂双层中[34,41]。需要指出的是,其他的磷脂如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)、PG、PE,也可以与tBid结合[20]。综上表明,在细胞发生凋亡时,包括心磷脂在内的一些磷脂可与Bid切割之后的产物在线粒体外膜进行结合,这对后续招募其他促凋亡蛋白(如Bax或Bak)聚集是关键的过程。

3.3 心磷脂与caspase-8蛋白

细胞凋亡途径一般认为有两条,分别是细胞外途径和细胞内途径。细胞外途径又称细胞表面死亡受体途径,属于caspase-8或caspase-10依赖的途径。细胞内途径与死亡受体途径不同,它不需要通过与死亡配体的结合,而是由线粒体引发。细胞损伤后,细胞色素c释放至胞质中,导致一系列细胞凋亡相关的蛋白质被激活,形成全酶复合物,构成凋亡小体,激活下游的caspase,引起DNA片段化而发生细胞凋亡。

Pro-caspase-8的募集与加工并形成有活性的caspase-8是死亡受体介导的细胞凋亡中的一个关键过程。Pro-caspase-8被证明主要定位在线粒体,在凋亡刺激下被活化[42]。一些研究表明,Fas死亡受体(Fas cell surface death receptor)的激活可诱导活化的caspase-8转位到线粒体外膜,并且这一过程依赖于线粒体外膜成熟心磷脂的存在[40]。心磷脂在这些过程中的作用可利用取自巴特综合征患者的淋巴母细胞进行证明。巴特综合征常累及酰基转移酶基因(tafazzin)的突变,tafazzin主要用于催化不饱和酰基链从磷脂酰胆碱转移到单溶血心磷脂。Tafazzin基因的功能丧失可导致总心磷脂水平减少,包括成熟心磷脂的减少,但单溶血心磷脂增加。巴特综合征患者的淋巴母细胞显示其强烈抵抗死亡受体激活。然而,利用重组tBid处理从巴特综合征患者淋巴母细胞中获得的线粒体却可以诱导Bak寡聚化和细胞色素c释放[40]。所以,在巴特综合征患者淋巴母细胞中tBid与Bax促进线粒体外膜通透化和细胞色素c的释放可能是由于增加了大量的单溶血心磷脂。进一步的研究发现,用Fas(一种介导细胞凋亡的细胞因子)刺激巴特综合征患者来源的细胞,可对Bid的切割产生明显的抑制作用,这表明巴特综合征患者细胞中存在caspase-8激活的缺陷。此外,在tafazzin基因敲除的HeLa细胞的线粒体中,人们发现加工后的caspase-8和切割后的Bid水平显著降低[40]。这些信息表明,成熟的心磷脂在Fas诱导的细胞凋亡中对caspase-8的激活发挥着重要的作用,提示心磷脂参与了细胞外凋亡途径。

综上所述,在凋亡过程发生时,心磷脂作为一个平台,可以将细胞色素c、Bid、caspase-8等蛋白质汇聚在一起,共同参与多个凋亡时期的过程,协调细胞程序性死亡。

4 心磷脂对细胞凋亡的作用在癌症中的研究

关于细胞凋亡的研究,人们最希望的是能找到一种特异性诱导癌细胞凋亡的方法。心磷脂是线粒体特异的磷脂,其对线粒体诱导的凋亡起着重要作用,与此同时,心磷脂相关的癌症方面的研究也引起越来越多的关注。例如:向宫颈癌细胞中导入心磷脂合成酶基因的干扰RNA,可降低心磷脂合成,从而增加宫颈癌细胞对凋亡刺激的敏感性[4]。近年来,相关研究人工合成了一种新型芳烃-尿素脂肪酸,发现这种脂肪酸可以靶向乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的线粒体,并耗尽线粒体上的心磷脂,表明这种芳烃-尿素脂肪酸可以使乳腺癌细胞的增殖能力下降,凋亡活性增强[43]。有研究将制作的细胞色素c-心磷脂(Cyt-CL)纳米微球孵育处理人卵巢癌细胞株(A2780),发现这种纳米微球可以促进卵巢癌细胞的凋亡[44]。研究报道,线粒体心磷脂中脂肪链的组成对前列腺癌细胞的增殖有不同的作用,与星形孢菌素STS处理过的细胞相比,棕榈酸对前列腺癌细胞(PC-3)的增殖有促进作用,油酸对前列腺癌细胞的增殖有抑制作用[45],这说明不同脂肪酸种类的心磷脂对细胞凋亡可发挥不同的抵抗力。除此之外,研究人员在大鼠癌症恶病质模型中发现,肝细胞中肿瘤坏死因子-α的高度表达,可以通过促进心磷脂的合成增加肝细胞线粒体内心磷脂的总含量,从而使线粒体能量浪费,并影响其生理功能[46]。综上研究,心磷脂与很多癌症细胞的凋亡和增殖有重要的相关性,如果能找到心磷脂相关的诱导癌细胞凋亡的方法,从而开展肿瘤靶向治疗,那将是一种很有前途的治疗癌症的方法。

5 结语与展望

心磷脂是近年来发现的一类与凋亡关系密切的脂质,其与凋亡关系的研究得到高度重视。心磷脂是线粒体特异的磷脂,其分布决定了其功能的重要性。在线粒体内,心磷脂可以维持线粒体的结构,也可以与线粒体蛋白质相互作用。心磷脂-细胞色素c复合体为细胞凋亡的起始设定了节奏,心磷脂与细胞色素c的相互作用也成为了如今细胞凋亡相关研究的新热点。心磷脂的过氧化促进了细胞色素c的释放,同时心磷脂自身也伴随着含量的降低及重新分布。除此之外,心磷脂作为一个平台,与细胞色素c、Bid、caspase-8等蛋白质相互作用,协调细胞程序性死亡。总之,在细胞凋亡过程中,心磷脂对线粒体内凋亡蛋白质作用的发挥具有必不可少的作用,因此也受到越来越多癌症研究者的关注。

另外,细胞发生凋亡时,常伴随着形态学的改变,比如细胞皱缩。细胞皱缩是由细胞内一些离子及水分的流失造成的,这一过程的发生离不开离子通道的开放[47]。许多研究已经证明,一些离子通道开放剂或阻断剂可以调控细胞凋亡过程的发生[48～49]。另外,许多膜脂具有调控离子通道的功能[50～52]。心磷脂也是一种脂类,在细胞凋亡时位置的迁移使之更有机会靠近细胞膜上的离子通道,其间会不会引起离子通道功能或开放状态的改变将会是我们研究的一个新方向。这一领域的研究或将为我们更深入地了解细胞凋亡的机制开辟新视角。