Xpert MTB/RIF在儿童肺结核诊断中的研究进展 *

王 宸，王 曼，杜君华，杜 洁

(1.西安医学院，西安 710021；2.陕西省人民医院体检中心，西安 710068)

世界卫生组织报告儿童结核病2016年全球约104万，占结核病总数的10%，20万儿童因结核病导致死亡[1]。其中，儿童肺结核病占70%～80%，多发生在结核病高负担国家。估计我国儿童结核病20万例，但年报告登记5 000～8 000例，结核病诊断和报告不足[1]。儿童肺结核以原发感染为主，肺部以原发性、浸润渗出病灶为多，空洞病变少见。结核分枝杆菌载量且痰排菌量低，儿童痰液留取困难，痰涂片镜检阳性率极低。因此，早期诊治儿童结核相对较困难。2014年世界卫生组织推荐利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(XpertMycobacteriumtuberculosisand rifampin-resistant，Xpert MTB/RIF)用于临床疑诊儿童结核病的初诊及防治。该技术在2 h左右检测结核分枝杆菌和利福平耐药情况，对儿童肺结核早期诊断有较高临床价值，具有里程碑意义[2-3]。现对Xpert MTB/RIF在儿童肺结核的研究及应用进展进行总结分析，以期更好地指导临床。

1 Xpert MTB/RIF系统的工作原理

Xpert MTB/RIF检测系统以rpoB基因为靶基因，用探针杂交方法检测合成rpoB基因是否存在突变。结核分枝杆菌rpoB基因为分枝杆菌依赖DNA的RNA聚合酶β亚单位编码基因，有保守和可变两种序列，具有显著种间相似度低和种内相似度高的特点，对分枝杆菌可进行有效的菌种鉴定。结核分枝杆菌对利福平耐药机制是由rpoB基因点突变造成，它可导致利福平无法和β亚基结合而失效。这种突变被分三个区域，耐利福平结核分枝杆菌菌株突变多集中在Ⅰ区[4-5]。以上述理论为基础，Xpert MTB/RIF用分子信标技术，对通过以半巢式实时定量PCR扩增的rpoB基因的192 bp片段进行检测，同一个反复多重反应体系中，使用互不重叠5个不同核酸分子杂交探针，分别标记不同荧光团，并以探针A～E命名选择性覆盖rpoB基因81bp核心区，该区域涵盖99.5%利福平耐药菌株突变部位。如果待检测样本rpoB基因存在突变，探针不能与PCR扩增产物很好杂交，则产生荧光部分或完全被抑制。结核菌耐药表型及耐药基因型关系确立，为基于利福平耐药基因rpoB突变为靶点诊断奠定基础[4-5]。Xpert MTB/RIF结核试剂盒用5条分子信标探针对结核分枝杆菌特有序列基因上81bp利福平耐药决定区(rifampin resistance determining region，RRDR)进行检测，第6条探针是用来做内部质控。当5条分子信标探针与目标靶序列特异性地配对结合，且5条探针均有荧光释放，结果判为结核分枝杆菌检测阳性。提示样品中存在对利福平敏感结核分枝杆菌，且无利福平耐药性；反之，结果判为结核分枝杆菌检测阴性。当5条分子信标探针中的一条或者几条不能很好地与之结合，检测出少于5条探针结果，提示样品中存在对利福平耐药的结核分枝杆菌，故靶序列上某个位点产生了突变，结果判为结核分枝杆菌检测阳性且对利福平耐药[6-7]。

2 Xpert MTB/RIF对儿童肺结核的诊断价值

Xpert MTB/RIF可对儿童肺结核做出早期诊断及治疗。鲁洁等[8]评估Xpert MTB/RIF在儿童结核病的诊断价值，用Revman5.3和Meta-Disc1.4统计软件进行文献质量评价和meta分析，共纳入7个国家13篇文献和4 661例标本。Xpert MTB/RIF用于诊断儿童结核病汇总灵敏度0.75(95%CI：0.72～0.79)，汇总特异度0.97(95%CI：0.96～0.97)，SROC曲线面积为0.88。对痰、胃液和鼻咽提取物三种样本meta分析，Xpert MTB/RIF检测痰灵敏度最优76%，痰和鼻咽提取物99%，优于胃液。对采用二次取样方法三项研究进行meta分析，二次取样可显著提高灵敏度，由54%提高至71%，且对试验特异度影响不明显(均为99%)。Xpert MTB/RIF对儿童结核病具有较高诊断应用价值。

2.1 Xpert MTB/RIF在支气管肺泡灌洗液中的应用研究 支气管肺泡灌洗是用支气管镜嵌入到肺段或亚段支气管水平，收集灌洗液。灌洗液涂片查找结核分枝杆菌等，可提高检出率，尤其适合无痰或排痰困难者。牛波等[9]收集确诊肺结核126份灌洗液标本，行罗氏培养基培养、药物敏感性试验和Xpert MTB/RIF检测。灌洗液中Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的检出率为59.52%，28份培养阳性标本检测结核分枝杆菌灵敏度为96.43%，98份培养阴性标本中，检测结核分枝杆菌灵敏度为48.98%。YIN等[10]对255例灌洗液用涂片、培养、药敏和Xpert MTB/RIF检测评估Xpert MTB/RIF检测价值。痰涂片、培养和Xpert MTB/RIF检测支气管肺泡灌洗液灵敏度分别为8.4%，28.9%和53%，三种方法特异度均为100%。Xpert MTB/RIF检测1例多耐药结核，与药敏结果一致。Xpert MTB/RIF 是一种快速、简便、阳性率高的检测方法，可在2 h内提供利福平耐药结核结果，为临床更快更早地提供诊断依据。

2.2 Xpert MTB/RIF在粪便标本中的应用研究 Xpert MTB/RIF检测粪便结核分枝杆菌有十分重要的意义。儿童生理特点决定频繁吞咽动作，其粪便中可检测到结核分枝杆菌，粪便更易收集。NICOL等[11]收集115例儿童肺结核粪便和痰标本行Xpert MTB/RIF检测。17例经培养确诊粪便中，Xpert MTB/RIF检测8例粪便结核分枝杆菌阳性，5例并发HIV感染粪便样本中检出4例样本结核分枝杆菌阳性，12例未被HIV感染的样本中检测出4例结核分枝杆菌阳性。Xpert MTB/RIF检测粪便结核分枝杆菌的灵敏度和特异度分别为47%和99%。以粪便为样本行Xpert MTB/RIF试验，需合理控制样本量大小及粪便菌种群量，以免其限制或杀死结核分枝杆菌影响灵敏度和特异度，而导致试验偏倚。WALTERS等[12]研究显示粪便中其他细菌生长速度过快致结核分枝杆菌培养阳性率低，以往以粪便为样本的Xpert MTB/RIF研究，结核分枝杆菌检出的灵敏度和特异度分别为25%～69%，91.7%～100%。灵敏度低除因粪便样本堵塞卡槽、PCR抑制之外，还可与粪便样本含量不足有关。WALTERS等[12]以Xpert MTB/RIF检测胃液/诱导痰液为金标准，Xpert MTB/RIF检测0.6 g和1.2 g粪便样本，采取一种创新处理粪便标本方法，用20例肺结核者和20例非肺结核对照研究。Xpert MTB/RIF检测0.6 g和1.2 g粪便灵敏度、特异度分别85%，84%和100%，94%。KOKUTO等[13]粪便XpertMTB/RIF检测诊断肺结核报告，痰涂片阳性中，粪便Xpert MTB/ RIF灵敏度100%，痰涂片弱阳性，灵敏度81.0%，痰涂片阴性灵敏度是50%；非肺结核组粪便Xpert MTB/ RIF检测均阴性，特异度100%。用这种创新粪便处理技术，粪便代替痰液，接近痰液样本Xpert MTB/RIF检测灵敏度和特异度，在诊断儿童肺结核方面是一种技术创新革命[14]。

2.3 Xpert MTB/RIF在胃液标本中的应用研究 儿童睡眠时会吞咽下部分痰液，清晨空腹留取胃液也可作为样本，进行Xpert MTB/RIF检测[15]。钱雪琴等[16]2014年研究胃液检测对儿童肺结核的诊断价值。84例患儿25例结核分枝杆菌培养阳性，阳性率29.8%，其中BACTEC MGIT 960系统与罗氏培养法的阳性率分别为26.2%及19%。痰涂片阳性者30例，阳性率35.7%，其中涂片阳性以下者占阳性病例的93.3%。胃液中分枝杆菌载量低，离心浓缩集菌、镜检仔细和多次送检标本或增加标本采集量是关键。SINGH等[15]收集130例可疑胸内结核病患儿的胃液和诱导痰液，样本被用于涂片、BACTEC-MGIT培养、多重PCR检查及Xpert MTB/RIF检测。对痰涂片和痰培养结果均为阳性的样本进行Xpert MTB/RIF检测，总灵敏度95.6%，对痰涂片阴性但培养阳性样本，灵敏度62.5%。胃液与诱导痰液合并为样本可提高Xpert MTB/RIF检测检出率。较长阶段储存后仍能保持较高的灵敏度和特异度，为儿童肺结核确诊提供相对长时间、能保留样本以便反复检测。

3 Xpert MTB/RIF在检测抗结核药耐药方面的价值

利福平是一线抗结核药物，可杀死生长分裂旺盛的结核分枝杆菌和慢生长或休眠期的病原菌，研究显示细菌对利福平的自发耐药率10-10～10-7。多项针对临床分离菌株的研究显示90%以上无流行病学关联的利福平耐药的结核分枝杆菌株在rpoB基因上81bp的核心区域，即利福平耐药决定区存在突变，包括点突变或短的插入、缺失突变，点突变是最常见的类型[17]。Xpert MTB/RIF检测技术对耐多药结核病的早期诊断和治疗有十分重要的意义。Xpert MTB/RIF试验以利福平耐药相关rpoB基因为靶基因检测结核分枝杆菌，所以是检测利福平耐药的直接手段，临床实践中可以指导用药。但其不能检测出其他一线和二线抗结核药物的耐药情况，独立的耐药相关基因突变可以相互作用影响耐药菌株适应性，称为“异位显性”作用，协同作用称为“正向显性”，拮抗作用称为“负向显性”。目前认为正向异位现象可能是促进耐多药和广泛耐药菌株广泛传播的主要原因，但临床实践中还需依靠药敏试验来判断耐药情况。

4 Xpert MTB/RIF与其他方法诊断价值的比较

Xpert MTB/RIF成人应用价值得到较多肯定，儿童肺结核方面文献相对较少。张爱梅等[18]评价Xpert MTB/RIF儿童结核病中应用价值，收集109例临床疑似结核病患者标本，分别进行荧光痰涂片镜检、液体培养、Xpert MTB/RIF检测及血结核T细胞斑点试验检测，Xpert MTB/RIF对疑似儿童结核病灵敏度28.6%，特异度87.5%。涂阳培阳标本中灵敏度均100%，涂阴培阳为50.0%；利福平耐药检测灵敏度及特异度均100.0%。Xpert MTB/RIF灵敏度(28.6%)优于荧光涂片(20.8%)，差异无统计学意义；与BACTEC MGIT 960的液体灵敏度27.3%相比，无统计学差异性；低于T细胞斑点试验(59.7%)，差异有统计学显著性意义。Xpert MTB/RIF检测在儿童结核病并不具有明显优势，但其迅速检测利福平耐药可为结核病诊疗提供帮助。Xpert MTB/RIF检测痰或胃液标本，对于痰培养阳性儿童肺结核灵敏度和特异度分别为62%～68%和98%～100%，阳性率是涂片镜检的1.7倍[19-20]。Xpert MTB/RIF除了用于检测呼吸道标本(如痰、胃液、鼻咽吸取物或支气管肺泡灌洗液)外，也可以用于检测粪便标本。培养阳性儿童肺结核粪便Xpert MTB/RIF检测的灵敏度为47%[21]。Xpert MTB/ RIF通过检测痰液诊断儿童肺结核的汇总灵敏度为62%，汇总特异度为98%。通过对支气管肺泡灌洗液和胃抽吸物这两种标本分别进行涂片、培养和Xpert MTB/RIF检测，均显示Xpert MTB/RIF的检测灵敏度显著高于另外两种方法[20]。LU等[22]分别对确诊结核儿童痰液、胃抽吸液、肺泡灌洗液和脑脊液等样本进行Xpert MTB/RIF检测，显示不同样本类型的阳性率显著不同，且胃抽吸液的检出阳性率最高[23]。HIV感染儿童结核中痰/胃抽吸物Xpert MTB/RIF灵敏度为60%，特异度为98%，粪便Xpert MTB/ RIF灵敏度63%和特异度99%[24]。田斌等[25]系统评价QFT-GIT对儿童肺结核临床诊断价值，用Stata软件进行meta分析，QFT-GIT对儿童肺结核诊断试验灵敏度点估计值为0.76，95% CI=0.65～0.84，特异度点估计值为0.98，95%CI=0.91～1.00。认为QFT-GIT具有排除肺结核诊断能力。纪丽微等[26]对2 284例评价Xpert MTB/RIF用于结核分枝杆菌联合检测价值，1 097例活动结核者、1 187例非结核者，Xpert MTB/RIF阳性检出率最高，灵敏度和特异度高，可取代结核分枝杆菌DNA荧光定量法加结核杆菌RNA恒温扩增加线性探针结核分枝杆菌耐药快速检测系统与离心浓缩涂片法、BACTECMGIT960液体培养及一二线药敏试验组成结核分枝杆菌联合检测，对结核病和耐多药结核病的快速诊断具有极高的应用价值。从目前研究无论痰还是非痰液标本的Xpert MTB/RIF检测阳性率相对较高，提高儿童肺结核的检出率。

5 Xpert MTB/RIF应用优点及局限性

Xpert MTB/RIF检测准确快速、安全性高、有较高灵敏度和良好特异度等特点，适合各级医院；Xpert MTB/RIF检测可对多样本检测，适用范围广，可以对儿童肺结核做早期诊断及耐药判断。但Xpert MTB/RIF系统对利福平耐药有假阳性，样本中存在异质性利福平耐药时结果难以判断，不能检测除利福平之外抗结核药物耐药。另外，对抗结核治疗者，Xpert MTB/RIF检测结果阳性不表示活动结核，不能以此判断疗效和结核预后。有学者对Xpert MTB/RIF 检测1 486例结果中常见异常原因行回顾分析。异常结果类型57份，占3.8%，出现“错误”、“无效”及“无结果”。其中，“错误”46份，占80.7%，“无效”6份，占10.5%，“无结果”5份，占8.8%。57例异常结果中，发生率较高的标本为胸腔积液、痰液和腹腔积液，而肺泡灌洗液和脑脊液等标本异常结果发生率较低[27]。但在Xpert MTB/RIF检测实际操作时多种原因可导致出现异常结果，其原因主要有人为因素、标本因素及实验室环境与仪器因素，个别试剂盒质量问题也可出现异常结果。样本体积过少或过多、对黏稠样本消化或样本孵育时间不充分、各种因素导致PCR反应抑制。标本黏稠、含有食物残渣或血液痰液标本、样本中含有色素颗粒如腹胸水标本中的色素颗粒容易堵塞PCR反应管尖端，出现异常结果。Xpert MTB/RIF检测技术质量控制体系缺陷、实验室环境及仪器因素等也可出现异常结果。