大肠杆菌代谢途径改造策略与应用研究进展

李冉 黄玉清 贾振华

（河北省科学院生物研究所，石家庄 050051）

大肠杆菌的代谢组学已研究的很透彻，与其他微生物相比，其自身的代谢途径更加稳定且易于改造，因此大肠杆菌作为一种工业微生物被广泛应用于代谢途径改造的研究。目前对大肠杆菌改造的研究集中在四条主要代谢途径，包括丙酮酸、乙酰辅酶A、甲羟戊酸和莽草酸代谢途径，用于醇类、有机脂肪酸、氨基酸、类异物二烯和芳香族化合物的合成。

大肠杆菌的系统代谢工程在生物燃料和砌块化合物的合成中均有研究和应用，它将整个生物过程的系统生物学和合成生物学相结合，有助于制定有效的策略改造微生物菌株，以便使目标化学品的生产产量和生产效率最大化，同时使整个上游和下游的工艺成本最小化。常用的技术主要包括自身代谢途径的基因敲除、过表达以及导入新的代谢途径。

本文综述了大肠杆菌系统代谢工程在自身代谢途径改造策略，在生产生物燃料、砌块化合物的微生物开发中所使用的工具和策略，以期为研究者以大肠杆菌合成目标化合物的研究提供一个整体的思路和方法。

1 大肠杆菌代谢途径的改造

1.1 丙酮酸代谢途径改造

丙酮酸是一种重要的有机中间体，可被用作L-色氨酸、L-酪氨酸和二羟基苯丙氨酸等药物的合成，也可用于阿托酸、丙酮酸乙酯等农药中间体的合成［1］。在大肠杆菌中，丙酮酸是糖酵解途径中重要的代谢中间体，可用于乳酸、丙氨酸、醋酸酯和乙酰辅酶A的合成，也可用于乙二醇、2，3-丁二醇和异丁醇等的合成［2-3］。目前对丙酮酸途径的改造主要有3种方式，第一，降低丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate dehydrogenase complex，PDHC）的活性，PDHC由3个亚基组成，包括aceE基因编码的EI亚基，即丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase）；aceF基因编码的E2亚基，即二氢硫辛酰胺转乙酰酶（Dihydrohpoamide transacetylase）；IpdA基因编码的E3亚基，即二氢硫辛酰胺脱氢酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase）。宋灿辉等［4］利用 Red重组系统构建了营养缺陷型菌株MG1655，敲除大肠杆菌PDHC中的aceE基因后，阻断了丙酮酸流向TCA循环，促进丙酮酸的累积。第二，降低α-酮戊二酸脱氢酶复合体（α-ketoglutarate dehydrogenase complex，AKGDH）的活性，AKGDH由3个亚基构成，包括sucA编码的E1亚基，即α-酮戊二酸脱羧 酶（α-ketoglutaratedecarboxylase，KCBX）；sucB基因编码的E2亚基，即硫辛酰转琥珀酰酶（Lipoyl transsuccillylase，LTS）及IpdA基因编码的E3亚基。Causey等［5-6］通过敲除atpFH、adhE、sucA基因来降低ATP合成、细胞生长和CO2产生的速率，从而加强从葡萄糖到丙酮酸的积累。第三，减少丙酮酸代谢支路，减少丙酮酸的消耗。大肠杆菌YYC202是一种被成功改造的用于丙酮酸积累的营养缺陷型菌株，突变了其中编码丙酮酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸氧化酶的基因，去除了可以消耗丙酮酸的下游代谢［7-8］。从目前的研究可以看出，促进大肠杆菌中丙酮酸的积累主要有两个策略，首先是提高丙酮酸的合成速度，降低反馈抑制调节；其次是去除丙酮酸的代谢支路，减少丙酮酸消耗。

1.2 乙酰辅酶A代谢途径改造

乙酰辅酶A是微生物自身代谢中重要的中间体，它既是TCA循环的起始化合物，也是脂肪酸合成的前体。通过丙酮酸盐，乙酰辅酶A可被转化为多种化学物质，包括1-丁醇、丁酸酯、S-3-羟基丁酸酯和聚 3-羟基丁酸酯［9-13］。

实现乙酰辅酶A的积累可通过两种方式，一是调节PDHC的活性，在有氧条件下，PDHC可将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，但是PDHC在缺氧或无氧条件下活性较低，为了解决这个问题，Kim等［14］将编码PDHC基因中的lpdA基因进行突变（将E354突变成K），使其在缺氧条件下保持活性。Boldt等［15］将肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumonia）中的lpdA基因突变（将D354突变成K）后，替换大肠杆菌中的lpdA基因，结果表明基因改造后的大肠杆菌可在氧含量较低的环境中生长，提高了菌体积累乙酰辅酶A的能力。二是代谢途径中相关基因的过表达。在丙酮酸合成乙酰辅酶A途径中，过表达PDHC中相关基因（如aceE、aceF、lpdA）已被应用于1-丁醇或脂肪酸的合成［16-17］。Lin等［18］通过过表达乙酰辅酶A合酶acs基因促进了醋酸酯转化为乙酰辅酶A，并且不影响大肠杆菌的生长。目前用于乙酰辅酶A积累的代谢途径改造主要是通过提高PDHC活性，促进丙酮酸盐向乙酰辅酶A的转化，以及过表达与乙酰辅酶A合成相关的酶，促进碳流流向乙酰辅酶A途径。

1.3 甲羟戊酸代谢途径的改造

近年来，甲羟戊酸作为萜类和类胡萝卜素的前体化合物备受关注，其用于药物、清洁能源和芳香类化学品具有广阔的应用前景［19-21］。甲羟戊酸代谢途径首先以乙酰辅酶A为前体，转化成甲羟戊酸，再通过三步反应转化为焦磷酸异戊烯酯（IPP），IPP是合成萜类化合物和类胡萝卜素的基本结构单元，但是由甲羟戊酸转化为IPP的代谢途径不存在于大肠杆菌中，其自身IPP的合成需要以甲基赤藓糖醇磷酸酯（DXP）作为前体，成为了大肠杆菌合成萜类化合物的主要限制因素。目前对大肠杆菌甲羟戊酸途径的改造只能通过引入异源代谢途径，Martin等［19］将黄花蒿（Artemisia annuaLinn）中的紫穗槐二烯合酶ads基因和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲羟戊酸代谢途径关键基因进行密码子优化，在大肠杆菌中构建了一个完整的异源甲羟戊酸代谢途径，最终生成青蒿素合成的前体物质紫穗槐二烯。Harada等［20］将来自于链霉菌的甲羟戊酸途径克隆到大肠杆菌中，然后转入a-蛇麻烯合酶基因，检测到目的产物的生成。Morrone等［21］在大肠杆菌中引入异源的甲羟戊酸代谢途径，结果表明异源代谢途径比内源性代谢途径产生更多的二萜化合物。由于甲羟戊酸是乙酰辅酶A的下游代谢，对大肠杆菌中乙酰辅酶A代谢途径的改造也可作为提高甲羟戊酸及其衍生物产量的一种策略。

1.4 莽草酸代谢途径的改造

莽草酸是一种环己烷的羟基化不饱和酸衍生物，具有防止血栓形成、消炎镇痛等作用，是合成神经氨酸酶抑制剂的关键组成部分［22］。大肠杆菌可利用莽草酸产生不同种类芳香族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等［23］。

对莽草酸途径的改造方式主要有3种，一是敲除莽草酸激酶基因，莽草酸激酶将莽草酸转化为3-磷酸莽草酸，敲除该基因可抑制莽草酸向下游代谢的转化。Draths等［24］通过敲除大肠杆菌中莽草酸激酶基因后，过表达对莽草酸积累有反馈抑制作用的AroF、AroE和AroB基因，避免了莽草酸激酶基因缺失后对菌体生长的影响。二是促进磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸赤藓糖（E4P）的合成，PEP和E4P是大肠杆菌合成莽草酸的前体，Noda等［25］在大肠杆菌中过表达PEP合成酶ppsA基因和转酮醇酶tktA基因，提高了PEP和E4P的合成效率。Gosset和Sengupta等［26-27］通过突变pykA和pykf基因，过表达tktA基因，抑制丙酮酸激酶活性和PEP介导的葡萄糖转运，增加了PEP在大肠杆菌中的可用性，这种方法被用于提高顺式-甲基丙烯酸和水杨酸的合成。三是减少副产物，促进反应向莽草酸方向进行，kramer等［22］敲除大肠杆菌中5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因aroA，过表达AroF、AroB和AroL基因，产生的3-磷酸莽草酸有助于推动反应向生成莽草酸的方向进行，同时副产物3-脱氢莽草酸的含量降低。

2 大肠杆菌用于生物燃料的合成

随着基因工程技术的发展和生物信息资源的日益丰富，微生物可以被改造成所需的工程菌用于多种生物燃料的合成，如1-丙醇、1-丁醇和烃类。1-丙醇是一种重要的化学品，可作为汽油替代品，应用于多种工业产品中［28］。Choi等［29］通过氨基酸生物合成途径的反馈抑制效应，去除大肠杆菌中的竞争代谢途径，增强2-酮丁酸酯的合成，随后引入adhE基因，并删除一个应激反应基因，改造后的大肠杆菌可分别以葡萄糖和甘油作为碳源合成1-丙醇。Jian等［30］将异源1，2-丙二醇代谢途径中的关键基因，包括丙酮醛合酶mgsA基因、丙二醇脱水酶budC基因、丙酮醛还原酶ydjG基因以及一个ppdABC操纵子，引入大肠杆菌中用于合成1-丙醇。1-丁醇也是一种重要的汽油替代品，传统的合成方式主要是利用梭状芽孢杆菌发酵产生［31-33］。大肠杆菌自身合成1-丁醇的能力较弱，Shen等［34］将丙酮丁醇梭菌（Clostri-dium acetobutylicum）的丁酰辅酶A基因和乙酰辅酶A酰基转移酶基因导入大肠杆菌中，敲除大肠杆菌中复合酸合成相关基因，增强了大肠杆菌合成1-丁醇的能力。烃类也是一种极具潜力的生物燃料。四碳到十二碳的短链烃类可作为汽油替代品，十三碳到十七碳的长链烃类可作为柴油替代品［35］。将蓝藻烷烃生物合成途径中的酰基载体还原酶AAR基因和醛脱羧酶ADC基因导入大肠杆菌中，可合成十三碳到十七碳的长链烃类混合物［36］。

3 大肠杆菌用于砌块化合物的合成

微生物代谢可产生不同种类的砌块化合物用于聚合物的合成，如二元羧酸、羟基酸、短链二元醇类和二胺类等由微生物的初级代谢产生。已有研究通过基因改造得到合成效率更高的工程菌，但实现商业化生产还需要进一步改进。二元羧酸主要包括琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、戊二醛、葡萄糖酸、己二酸和3-羧基木糖酸等，其中对琥珀酸合成的研究较多，早期已有研究者将改造后的大肠杆菌应用于有氧、无氧和有氧-无氧3种发酵方式中［37-39］。后续有研究者将有氧条件下合成琥珀酸的代谢系统导入大肠杆菌中，提升了琥珀酸的合成效率。他们将三羧酸循环途径以及副产物产生途径改造成乙醛酸循环和三羧酸循环的氧化支路，使得大肠杆菌在能够保证正常的生长状态下，有效积累琥珀酸。随后将谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）中的丙酮酸羧化酶pyc基因在大肠杆菌中过表达，促进草酰乙酸合成并且增强向三羧酸循环氧化支路的离子流，最终提高了大肠杆菌在有氧条件下发酵产生琥珀酸的产量，达到36.1 g/L［40］。

短链二醇类是生产聚酯和其他化学品的砌块化合物，可由微生物自身代谢和改造后的代谢途径产生多个种类，如1，3-丙二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇和1，3-丁二醇。微生物生产1，4-丁二醇体现了代谢途径基因改造工程在工业菌株设计上的应用和发展。Boldt等［41］利用代谢途径识别软件（SimPheny bioPathway predictor）从一些常用的代谢中间体设计能合成1，4-丁二醇的代谢途径，再根据代谢途径的长度、热力学和产率选择最佳途径对大肠杆菌进行改造，随后又通过生物信息学分析基因组代谢组分和密码子优化技术，敲除部分基因进一步优化合成途径，最终1，4-丁二醇的产量可达到18 g/L。本实验室利用羰基还原酶在大肠杆菌中过表达合成R-1，3-丁二醇，R-1，3-丁二醇的产量为8 g/L。

羟基酸及其手性化合物不仅可用作生产药物、维生素、抗生素和风味化合物的前体，也可作为生物单体用于合成聚酯。它们包括乳酸、3-羟基丙酸酯、3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯［42-45］。微生物基因工程应用于乳酸的合成较为成功，其中大肠杆菌以葡萄糖或甘油作为碳源过量生产乳酸的研究最具潜力。研究者对大肠杆菌中氧化还原反应的全基因组分析表明，在厌氧条件下，D-乳酸过量产生是由与核苷酸和氨基酸代谢有关的单个脱氢酶基因决定的，如guaB、pyrD和serA。此外，敲除与厌氧转录调控有关的guaB、pyrD、serA、fnr、arcA或arcB基因可增强D-乳酸的过量生产［46-48］。

4 总结与展望

本文综述了大肠杆菌中丙酮酸、乙酰辅酶A、甲羟戊酸、莽草酸4个代谢途径的改造策略，以及大肠杆菌用于合成生物燃料和砌块化合物所采用的系统代谢工程策略。已有的研究表明，将系统生物学和合成生物学整合到代谢工程中，在开发能够高效生产目标化合物的工程菌株方面有巨大的前景。本实验室利用该策略对大肠杆菌进行改造实现了R-3-奎宁醇的中试生产，该策略也成功用于氨基酸、乳酸、琥珀酸、1，4-丁二醇和1，3-丙二醇的生产。利用改造后的大肠杆菌生产目标化合物仍存在一些需要改进的地方，包括最大限度地提高产物纯度、产量和反应效率；在工业化应用时，需要综合考虑上下游工艺的可操作性和匹配性。系统代谢工程将在减少菌株反应时间、降低反应成本以及生物工艺开发方面发挥越来越重要的作用，最终实现目标化合物的工业化规模生产。