芽孢杆菌在农业生产中的应用

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(1.牡丹江师范学院 生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157012；2.中国科学院 东北地理与农业生态研究所 黑土区农业生态重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150081；3.黑龙江省畜牧研究所，黑龙江 齐齐哈尔 161005；4.中国烟草总公司 黑龙江省公司烟草科学研究所，黑龙江 哈尔滨 150076)

0 引 言

芽孢杆菌(Bacillusspp)是一类好氧或兼性厌氧、杆状革兰氏阳性细菌。它能产生对高温、干燥、电离辐射、紫外线及多种有毒化学物质均有较强抗性的芽孢。芽孢杆菌广泛存在于土壤、动物肠道、植物体内、空气以及水体等环境中，并易于从土壤和植株中分离获得，具有抗逆性强，营养要求简单，繁殖速度快且稳定性强等生物特性。一些芽孢杆菌因其具有能够降解土壤中难溶的含磷、含钾等化合物，防治植物病虫害，调节哺乳动物肠道微生态和分解原油等功能，在工农业和医学领域的应用十分广泛。

芽孢杆菌是重要的资源微生物之一，与人类活动息息相关。如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)在工业中用于生产酶、抗生素、溶剂及其他成分[1]。此外，像苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和球形芽孢杆菌(B.sphaericus)由于它们的杀虫活性，在植物虫害防治中被广泛应用[2]，而蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)具有促进植物生长的能力[3]。但是，某些芽孢杆菌存在一些负面的影响，如炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)可使动物发生炭疽热，蜡状芽孢杆菌(B.cereus)能污染乳制品等食品，造成食物中毒[4]。

目前，国外已有一些芽孢杆菌产品作为商品生产和出售，枯草芽孢杆菌MBI600、QST713、GB03及解淀粉芽孢杆菌FZB24等4株芽孢杆菌，得到美国环境保护署(EPA)商品化或有限商品化生产应用许可[5]。菌株GB03(商品名Kodiak)，对镰刀菌(Fusarium)、曲霉菌(Aspergillus)和丝核菌(Rhizoctonia)等病原菌引起的根部病害有很好的防控效果；QST713(商品名Serenade)粉剂，可抑制枯萎病和灰霉病病原真菌菌丝生长；菌株MBI600 (商品名 Subtilex)可防治由镰刀菌、曲霉菌等引起的豆类、棉花和花生等作物根部病害；FZB24(商品名TaegroTM)可防治镰刀菌、丝核菌引起的根腐病和枯萎病[6]。此外，日本东京技术研究所的枯草芽孢杆菌RB14和NB22，能很好地抑制立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和青枯菌(Pseudomonassolanacearum)引起的番茄病害[7]。

国内在利用芽孢杆菌防治植物病害方面也取得较大进展。百抗、麦丰宁和纹曲宁等芽孢杆菌商品，已获得农业部登记注册，并推广使用。南京农业大学植保学院研发的枯草芽孢杆菌B3(商品名麦丰宁)，对小麦纹枯病田间防效为50%～80%[8]，生防机制表现为抑制小麦纹枯病病菌菌丝生长和菌核的形成与萌发。此外，江苏农科院植保所[9-10]开发的枯草芽孢杆菌Bs-916，已进行农药登记，对水稻纹枯病田间防效稳定在60%～81%，年应用面积达6.7×104hm2。本文针对常见芽孢杆菌的种类，拮抗、溶菌和解磷等作用机制及应用现状进行综述，以期促进芽孢杆菌在农业生产中的应用。

1 常见芽孢杆菌种类

早在1835年，Ehrenberg就发现并命名了枯草芽孢杆菌[11]。1872年，德国植物学家Cohn建立了第一个细菌分类系统，根据细菌的形态特征命名了芽孢杆菌属(BacillusCohn)[12]。芽孢杆菌传统分类方法主要是根据形态特征和革兰氏染色等观察方法，而目前多采用多相分类法，即将生理、生化、分子(G+C mol%分析、DNA-DNA杂交和16S rRNA测序等)及化学(脂肪酸分析、全细胞蛋白SDS-PAGE分析和磷酸类脂分析等)等方法相结合，对其种类进行综合划分。表1是一些有代表性的芽孢杆菌属不同种的遗传及生物学特性。

2 作用机制

2.1 拮抗作用

拮抗作用是指一种微生物抑制或杀死另一种微生物的现象，是芽孢杆菌抑制病原菌的主要途径。芽孢杆菌除可分泌抗生素如细菌素、脂肽类化合物及聚酮类化合物等外，还可产生抗菌蛋白(酶类和抗菌多肽类)[25]。伊枯草菌素(Iturin)是一类能够强烈抑制真菌生长的脂肽类化合物，B.subtilisM51[7]可产生能够抑制多种丝状真菌生长，且能抑制尖孢镰刀菌对番茄侵染的伊枯草菌素A2。生防菌枯草芽孢杆菌F2923[26]能产生由10个α-氨基酸肽与β-羟基饱和或非饱和脂肪酸链(C14-C18)形成内酯环的泛革素(Fengycin)，对丝状真菌有很强的抗真菌活性。张宝俊等[27]发现，解淀粉芽孢杆菌LP-5产生的抗菌蛋白能够抑制梨黑斑病菌(Alternariaalternata)孢子萌发和菌丝生长，造成孢子萌发端泡囊化、菌体破裂和原生质外渗，进而防治梨黑斑病害的发生。

2.2 促生作用

多种芽孢杆菌能产生植物生长素(IAA)、玉米素(ZT)、赤霉素(GA)和细胞分裂素(CTK)等，对植物有显著的促生效果[28]。郭芳芳等[29]发现多粘芽孢杆菌CF05的发酵液与菌悬液对番茄幼苗均具有明显的促生效果。何红等[30]筛选的内生枯草芽孢杆菌BS-2对植物生长有促进作用，可在植物体内定殖，对蔬菜苗期立枯病有良好的防治效果。江苏省农业科学院植物保护研究所[31]分离获得的解淀粉芽孢杆菌B1619，能促进番茄生长，且促生物质主要存在于上清液中。朱忠彬等[32]研究烟草根际生防菌株短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)DZQ3对烟草的促生效果及诱导系统抗性，研究结果表明，该菌株可促进烟草的生长发育，能够诱导系统抗性，增强烟草的抗病能力。

表1 芽孢杆菌代表性种类、遗传及生物学特性Table 1 Typical species of Bacillus and their genetic and biological features

2.3 诱导植物抗病性

芽孢杆菌不仅能够抑制植物病原菌的生长繁殖，而且可以诱发植物抗病潜能增强植物抗病性，即诱导植物抗性(Induced systemic resistance，ISR)。有研究表明，参与植物体生理生化反应的保护酶，如过氧化物酶(Peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase， PAL)和多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)，当植物受到病原菌侵染后，植物体内的这些保护酶活性增强，从而提高植株的抗病性[33]。唐文等[34]发现，枯草芽孢杆菌Czk1能促进橡胶树抗病相关酶CAT、POD、PAL和PPO活性升高，诱导橡胶植株产生抗性。枯草芽孢杆菌B29能诱导黄瓜根系PAL、POD和PPO活性增强，对黄瓜枯萎病有良好防效[35]。薛玉潇[36]研究发现，解淀粉芽孢杆菌bwa7能诱导PAL、PPO、POD、SOD和CAT活性增强，从而提高香蕉对病原真菌的抗性。另外，曹舜[37]分离获得的短小芽孢杆菌BS-4菌株能够诱导大豆植株的PAL、POD和PPO的活性，对大豆疫霉病菌有很强的抑制作用。

2.4 营养和空间位点竞争

营养和空间位点竞争是指存在于同一个微生态位中的2个或多个微生物之间对空间、营养和氧气等进行竞争的现象，是芽孢杆菌防控病原菌的重要生防机制之一。生防芽孢杆菌通过有效的营养和空间位点竞争，定殖于植物根际、体表或体内以及土壤中，占据病原菌的生态位点，达到抑制植物病原菌对植物的侵染和定殖，达到抑菌控病效果[38]。黎起秦等[39]研究发现，枯草芽孢杆菌B47能在土壤及番茄植株中定殖，对番茄青枯病的防治效果达到79.8%。杨洪凤等[40]研究结果表明，解淀粉芽孢杆菌CC09菌株在小麦叶内和叶际能稳定定殖，对小麦白粉病的防效高达95%。凌筝等[41]研究发现，地衣芽孢杆菌W10能在苹果、柑橘果实表面定殖，能够有效防治水果采摘后病害的发生。

2.5 溶菌作用

溶菌作用，是指当生防菌在生长过程中分泌产生溶菌物质并作用于病原菌菌丝，导致病原菌菌丝生长受到抑制，主要表现为菌丝生长变缓慢、菌丝形态怪异，出现菌丝断裂、变粗、肿大、解体和细胞质消解，甚至出现菌丝原生质溶解等；或者产生的溶菌物质能够使病原菌孢子细胞壁出现穿孔、畸形等现象[42]。林福呈等[43]研究枯草芽孢杆菌S9对植物病原真菌的溶菌作用，发现菌株S9能吸附在立枯丝核菌的菌丝上,并随菌丝生长而生长,然后产生溶菌物质消解菌丝体，从而达到防治立枯丝核菌引起的番茄早期病害。代玉立[44]从油菜根际土壤中分离获得的枯草芽孢杆菌RSS-1，能使油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)的菌丝细胞壁增厚、皱缩、畸形，并有明显的原生质外渗现象，能显著抑制核盘菌侵染油菜叶片，菌株RSS-1对灰葡萄孢属(Botrytiscinerea)、单端孢属(Trichothecium)和炭疽菌属(Colletotrichum)等41株植物病原真菌均有抑制作用，尤其对灰葡萄孢属真菌的抑菌效果最好，其抑菌率达到90%以上。此外，郝晓娟等[45]对从番茄根围土壤中分离得到的短芽孢杆菌JK-2的研究发现，其能够抑制枯萎病菌菌丝及病菌孢子的萌发，抑制率在无菌滤液中浓度为15%时，可达到81.7%。

2.6 解磷作用

目前具有解磷作用的芽孢杆菌包括巨大芽孢杆菌[52]、侧孢芽孢杆菌[53]、短小芽孢杆菌[54]和胶质芽孢杆菌(B.mucilaginosus)[55]等。杜春梅等[56]获得的4株侧孢芽孢杆菌BL-11、BL-12、BL-21和BL-22均具有解磷能力，当以氧化乐果和水胺硫磷为唯一磷源时，菌株BL-21和BL-22的解磷效率均高于BL-11和BL-12，而以Ca3(PO4)2为唯一磷源的结果是BL-11和BL-12的解磷效率高于BL-21和BL-22。有研究表明，枯草芽孢杆菌NCD-2不仅能够抑制棉花黄萎菌等植物病原真菌，同时还具有降解有机磷的能力[57]。此外，芽孢杆菌除具有解磷作用外，还具有解钾作用。如刘五星等[58]以不同的硅酸盐矿物(钾长石粉、云母粉和土壤矿物)作为唯一钾源对胶质芽孢杆菌NS05的解钾作用进行了研究，发现该菌对多种硅酸盐矿物均有分解作用，其解钾能力可能与其荚膜多糖的独特结构有关。

3 常用芽孢杆菌的应用

目前，植物病虫害主要是以化学防治为主，虽然在一定程度上能够有效地控制病虫害发展，但是长期使用会造成严重环境污染，同时会导致靶标生物产生抗药性，杀菌杀虫效果降低甚至消失。由于芽孢杆菌具有生长迅速，对人畜安全无害，营养需求简单，抗逆性强及易于生长繁殖等优点，多年来一直成为被广泛关注和研究的生防微生物。目前，研究较多的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等。

3.1 苏云金芽孢杆菌

苏云金芽孢杆菌于1901年在日本被发现，由柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，并依其发现地点德国苏云金省而命名，是目前应用最广泛的微生物杀虫剂，在其芽孢形成过程中同时也形成具有杀虫活性的伴孢晶体[59]，用于防治植物虫害，不仅对环境无污染，而且对人畜无害。苏云金芽孢杆菌防治的目标昆虫主要是鳞翅目、鞘翅目、双翅目和直翅目等。如何献君[60]分离获得的苏云金芽孢杆菌SC-1对鳞翅目昆虫菜青虫幼虫具有致病性。此外，苏云金芽孢杆菌对防治动物捻转血矛线虫、血吸虫病和猪蛔虫病等也有较好的防效。如黄大野等[61]发现，在温室条件下苏云金芽孢杆菌NBIN863菌株对番茄根结线虫防治效果可达到54.5%。此外，还有许多常见的芽孢杆菌作为杀虫剂被广泛应用，如蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、蜂房芽孢杆菌(B.alvei)、幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、日本金龟子芽孢杆菌(B.popilliae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、森田芽孢杆菌(B.mortai)和尘埃芽孢杆菌(B.pulvifacricus)[62]。

3.2 枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌中应用较为广泛的菌种之一，广泛存在于农耕土壤中，一些分离株已经显示出具有抑制不同植物病原菌和促进植物生长的能力[63]。目前研究证明，枯草芽孢杆菌对水稻、大豆、棉花、小麦、番茄和玉米等农作物病害有良好的防治效果。中科院东北地理与农业生态研究所筛选的枯草芽孢杆菌BRF-2，对多种植物病原真菌的生长均有明显抑制作用，盆栽及田间试验表明其对大豆根腐病菌具有较好的防效作用并能促进大豆生长[64]。Collins等[65]发现，枯草芽孢杆菌菌株BacB可以减少尾孢菌属甜菜叶斑的发病率；Leifert等[66]发现，菌株CL27能抑制幼苗葡萄孢菌生长；Touré等[67]研究发现，菌株GA1能降低灰霉菌感染；Murphy等[68]研究发现菌株IN937b能够降低由番茄斑点病毒引起的疾病发病率和发病程度。蔡璘等[69]研究枯草芽孢杆菌对烟草白粉病的抑制作用，其田间实验结果表明，枯草芽孢杆菌对烟草白粉病的田间防效可达70%以上，还能有效抑制烘烤过程中白粉病菌的二次侵染，可促进烟草叶片生长。此外，枯草芽孢杆菌不易产生毒性物质，该菌可通过调节动物胃肠道菌群平衡，增强机体的免疫功能，提高动物的生产性能；该菌能净化水质，改善水体环境；对粪便进行无公害处理；吸附环境中的重金属，是一种绿色、安全无污染的微生物资源[70]。

3.3 解淀粉芽孢杆菌

解淀粉芽孢杆菌是广泛存在于自然界的一种非致病性细菌，是发酵期的优势菌种之一。在食品工业中能够促进发酵过程中的豆瓣体系中的淀粉快速分解，产生有机酸和双乙酰等香气物质[71]。钟泓波等[72]将从深海海泥中筛选出产碱性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌运用于豆粕发酵中，发现该菌能明显提高发酵液的抗氧化能力。李超等[73]从滇池富营养化水体中分离获得一株分泌胞外代谢物，具有溶藻功能的解淀粉芽孢杆菌DC1，发现其具有抑制水华鱼腥藻的作用，而这种抑制效果随着菌体浓度的增大而显著提升。时威等[74]研究发现，解淀粉芽孢杆菌发酵液能有效地抑制冷却肉中的主要污染菌-假单胞菌和潜在致病菌-单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)污染，延长保质期6～9 d，效果优于Nisin(乳酸链球菌素，一种非常有效的微生物生产的食品防腐剂)。郝卫宁等[75]发现，解淀粉芽孢杆菌菌株HC-03的发酵液、菌悬液及发酵滤液能降低沙糖桔活体接种试验柑桔绿霉病的发病率及病斑直径。

3.4 地衣芽孢杆菌

地衣芽孢杆菌在防治烟草黑胫病、棉花黄萎病及水稻稻瘟病等均具有显著效果。令利军等[76]研究发现，地衣芽孢杆菌TG116菌株能诱导黄瓜叶片中PPO、POD及PAL等3种防御酶活性增强，提高植株抗病性。纪兆林等[77]发现，地衣芽孢杆菌W10菌液及其产生的抗菌蛋白浸果处理能推迟贮藏期桃褐腐病腐烂时间，显著降低贮藏期的腐烂率。张笑宇等[78]研究发现，地衣芽孢杆菌可明显抑制马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)菌丝生长、游动孢子释放和游动孢子萌发，为该菌株在生物防治中的应用提供理论基础。

3.5 凝结芽孢杆菌

凝结芽孢杆菌又名孢子性乳酸菌，不仅可以增强免疫反应，防治病毒感染(甲型流感病毒)，还可以对肠道菌群的平衡进行快速恢复，阻止病毒进入肠粘膜和血液。张维娜等[79]研究结果表明，饲料中添加0.3%凝结芽孢杆菌可较好地促进异育银鲫幼鱼的生长，提高机体免疫力。付天玺[80]发现，在饲料中加入不同剂量的凝结芽孢杆菌均能显著提高奥尼罗非鱼胃、肝胰脏和肠道蛋白酶活性。凝结芽孢杆菌可促进尖吻鲈的生长，并可以提高其肠道淀粉酶及胃蛋白酶的活性，但对血清免疫酶的影响较小[81]。孙焕林等[82]在凝结芽孢杆菌对黄羽肉鸡生长性能、肠道功能及肉品质的影响研究中表明，在日粮中添加1.5‰的凝结芽孢杆菌制剂，可以明显提高黄羽肉鸡的生产水平。张越等[83]发现，在日粮中添加凝结芽孢杆菌可以改善断奶仔猪的肠道菌群，降低仔猪的腹泻率。

3.6 其他芽孢杆菌

除上述常用芽孢杆菌种类外，其他种类的芽孢杆菌也有相关报道。如刘幸红等[84]采用室内对峙培养和林间喷雾防治等方法测定坚强芽孢杆菌Bf-02对核桃炭疽病的防治效果，结果表明菌株Bf-02对病原菌有抑制作用，防效均为80%以上。王静等[85]对短小芽孢杆菌AR03抑制烟草赤星病菌和白粉病菌研究中发现，AR03菌液对2种病菌的菌丝生长和孢子萌发均有明显的抑制作用。此外，Swadling等[86]发现短小芽孢杆菌 NCIMB13374能抑制草莓灰霉病菌的生长。徐玲等[87]研究发现，多粘芽孢杆菌HY96-2对植物青枯病具有明显的防治效果。

4 展 望

许多芽孢杆菌能防控多种植物病虫害，且具有对人畜无害，不污染环境，靶标病虫不易产生抗药性及促进作物生长等优点，符合消费者对农产品安全性以及产品质量的需求，在农业生产和病虫害综合治理(IPM)方面有重要意义，能产生巨大的经济和社会效益。尽管目前芽孢杆菌在农业上的应用已取得了长足的进步，利用芽孢杆菌开发的生防菌剂和生物制剂被广泛应用，但芽孢杆菌在生产应用中仍存在一些问题，其主要是在室内条件下筛选的拮抗菌株在田间应用时很容易受气候环境和植物微生态中多种因素的影响，从而无法发挥稳定有效的防治效果。因此，如何筛选、基因改造、生产出适用于田间具有广谱效果的生防菌株还需加强研究，也是一个永恒的课题。芽孢杆菌产生的抗菌肽可抑制多种植物病原真菌，抗菌谱广，种类多，绿色安全无污染，但是对于抗菌肽分离和应用研究不多，作用机制也尚不清楚。此外，微生物菌肥不是单一的一株菌种，往往是多菌种混合应用的复合菌剂，而复合菌系存在着菌种间营养和空间位点竞争的现象，如何研制出稳定性高的复合菌剂是芽孢杆菌生防和促生效果研究的另一个课题。