甲状腺癌中骨桥蛋白、E-钙黏蛋白、β-连环蛋白的表达及其与预后的关系

赵文辉

(青海大学附属医院病理科，青海省西宁市 810000，电子邮箱：zhaowenhui1978@163.com)

甲状腺癌是头颈部和内分泌系统最常见的恶性肿瘤，其已成为女性第五大恶性肿瘤病，也是我国30岁以下女性中最常见的恶性肿瘤[1-2]。甲状腺癌的发生与性别、环境及遗传因素有关，通过早期诊断采用根治手术结合促甲状腺激素抑制与放射治疗，可提高患者生存率，但不同分型的甲状腺癌治疗敏感度具有较大差异，部分对放化疗均不敏感者的死亡率仍较高[3]。因此，研究与甲状腺癌发生、发展及转移相关的标记物已成为研究的热点。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种磷酸糖蛋白，有研究表明其与肿瘤细胞的转移及临床预后密切相关[4]。E-钙黏蛋白是Ca2+依赖性细胞黏附因子，主要介导细胞间黏附及维持细胞骨架，其表达缺失或异常将引起细胞离散，与上皮组织恶性肿瘤的发生、发展密切相关[5]。β-连环蛋白是细胞黏附分子与信号转导分子，可参细胞增殖、分化与凋亡。本研究探讨甲状腺癌中OPN、E-钙黏蛋白及β-连环蛋白的表达水平及其与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2012年5月至2017年6月本院收治的甲状腺癌患者58例，取其病理确诊的甲状腺癌组织及癌旁>2 cm处正常甲状腺组织作为对照，所有患者术前均未进行放疗、化疗。其中男16例，女42例；>45岁25例，≤45岁33例；病理分型：乳头状癌33例，滤泡癌14例，髓样癌6例，未分化癌5例；分化程度：低分化31例，中分化17例，高分化10例；肿瘤分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ期12例，Ⅳ期10例；有包膜浸润40例，无包膜浸润18例；淋巴结转移23例，无淋巴结转移35例。所取甲状腺癌组织及癌旁正常甲状腺组织均做石蜡包埋。

1.2 检测方法 免疫组化(S-P法)：将组织蜡块切片(4 μm)后，放入60℃温箱烤片1 h，以防止脱片；经脱蜡、水洗后加入3% H2O2，室温孵育10 min，然后用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗3遍；将切片放入1.0%的枸橼酸缓冲液(pH=6.0)沸水中持续煮沸2 min后取出，自然冷却，PBS冲洗3遍，除去切片上多余的PBS；加入山羊血清37℃孵育15 min，倾去不洗；加一抗[OPN鼠抗人单克隆抗体(批号：ZM-0174)、E-钙黏蛋白鼠抗人单克隆抗体(批号：ZM-0092)(即用型)、β-连环蛋白鼠抗人单克隆抗体(批号：ZM0422)(即用型)]，37℃孵育60 min(阴性对照PBS代替一抗)，一抗均购置北京中杉金桥生物技术有限公司；滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS冲洗3遍，除去切片上多余的PBS；滴加新鲜配制的3，3′-二氨基联苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)溶液显色(DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，批号：81215710)，用已知阳性组织切片作阳性对照。

1.3 结果判定 每份组织切片均任意选10个高倍视野，每个视野分别计数100个细胞，共计1 000个细胞，计算阳性细胞百分率。OPN阳性表达主要定位于细胞质，细胞质呈棕黄或棕褐色为阳性细胞，阳性肿瘤细胞数<10% 为阴性(-)，≥10%为阳性(+)。E-钙黏蛋白阳性表达主要定位于细胞膜，细胞膜出现黄棕色颗粒为阳性细胞，无色为阴性细胞，单纯细胞核和细胞质阳性亦为阴性细胞。参照Gofuku等[6]的方法，E-钙黏蛋白细胞膜阳性细胞数>70%为阳性表达(+)，≤70%为表达缺失即阴性表达(-)。β-连环蛋白阳性主要在细胞膜表达，参照Maruyama等[7]的方法判断，β-连环蛋白胞膜阳性细胞数>70%为阳性表达(+)，≤70%为表达缺失即阴性表达(-)。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计数资料以例数和百分比表示，比较采用χ2检验；分类变量的相关性采用关联性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 OPN、E-钙黏蛋白、β-连环蛋白在甲状腺癌组织及正常甲状腺组织中的表达情况 OPN在甲状腺癌组织样本中阳性表达率为79.31%，在正常甲状腺组织中阳性表达率为15.52%，甲状腺癌组织中OPN阳性表达率高于正常甲状腺组织(P<0.05)；E-钙黏蛋白在甲状腺癌组织样本中阳性表达率为34.48%，在正常甲状腺组织中阳性表达率为87.93%，甲状腺癌组织中E-钙黏蛋白的阳性表达率低于正常甲状腺组织(P<0.05)；β-连环蛋白在甲状腺癌组织中的阳性表达率为74.14%，在正常甲状腺组织中的阳性表达率为6.90%，甲状腺癌组织中β-连环蛋白阳性表达率高于正常甲状腺组织(P<0.05)。见表1。

表1 OPN、E-钙黏蛋白和β-连环蛋白在甲状腺癌组织及正常甲状腺组织中的表达[n(%)]

2.2 OPN、E-钙黏蛋白、β-连环蛋白在甲状腺癌组织中的表达情况与临床病理参数的关联性分析 OPN在甲状腺癌组织中的表达与性别、年龄均无关(均P>0.05)，但与病理分型、分化程度、肿瘤分期、包膜浸润、淋巴结转移均相关(均P<0.05)，见表2。E-钙黏蛋白及β-连环蛋白的表达与性别、年龄、病理分型、分化程度、肿瘤分期均无关(均P>0.05)，但与包膜浸润、淋巴结转移均相关(均P<0.05)，见表3～4。

表2 OPN在甲状腺癌组织中的表达情况与临床病理参数的关联性分析[n(%)]

表3 E-钙黏蛋白在甲状腺癌组织中的表达情况与临床病理参数的关联性分析[n(%)]

续表3

表4 β-连环蛋白在甲状腺癌组织中的表达情况与临床病理参数的关联性分析[n(%)]

2.3 甲状腺癌组织中OPN、E-钙黏蛋白及β-连环蛋白表达之间的相关性分析 甲状腺癌组织中OPN表达与E-钙黏蛋白表达具有相关性(χ2=0.412，P<0.001)；而OPN表达与β-连环蛋白表达则无相关性(χ2=0.061，P=0.510)；甲状腺癌组织中的E-钙黏蛋白表达与β-连环蛋白表达具有相关性(χ2=0.370，P<0.001)。

2.4 OPN、E-钙黏蛋白、β-连环蛋白表达与甲状腺癌预后的关系 OPN阳性表达患者的5年生存率为81.03%，低于阴性表达患者的94.83%(χ2=3.980，P=0.046)；E-钙黏蛋白阳性表达患者5年生存率为93.10%，阴性表达患者生存率为89.66%，两者差异无统计学意义(χ2=0.109，P=0.741)；β-连环蛋白阳性表达患者的5年生存率为87.93%，阴性表达患者生存率为91.38%，两者差异无统计学意义(χ2=0.093，P=0.760)。

3 讨 论

甲状腺癌是临床上发病率较高的恶性肿瘤之一，可发生于任何年龄段人群，但高发于中青年女性。甲状腺癌临床症状不明显，大部分患者缺少典型的恶性表现，多数患者通过常规体检以及病灶转移后发现。甲状腺癌的发生、发展过程与多种分子机制相关，通过对这些相关分子机制的研究可为甲状腺癌的早期诊断提供潜在的分子标志物及治疗靶点，有助于恶性程度高及预后性差患者的早期治疗。

OPN是分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，是细胞信号转导途径中的重要介导者，含有特异性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列。OPN在正常细胞中呈缺乏或低表达状态，而在多数恶性肿瘤中呈高表达。OPN与整合蛋白αVβ3及黏附分子CD44受体结合，改变细胞行为，介导细胞黏附、迁移、浸润以及诱导肿瘤新生血管形成、促进恶性肿瘤的发展与转移[8]。周行等[9]研究显示，OPN在宫颈鳞癌中呈阳性表达，其阳性表达率与组织学分级、淋巴结转移及预后不良有关，阳性表达患者总生存率低于阴性表达患者。本研究结果显示，OPN在甲状腺癌组织中阳性表达率高于正常甲状腺组织，且与病理分型、分化程度、肿瘤分期、包膜浸润、淋巴结转移相关(均P<0.05)，提示OPN高表达与甲状腺癌的发生、发展、浸润及转移密切相关。本研究结果还显示，甲状腺癌组织中OPN与E-钙黏蛋白具有相关性(P<0.05)，而与β-连环蛋白无相关性(P>0.05)；OPN阳性表达患者5年生存率低于阴性表达患者(P<0.05)，提示OPN阳性与甲状腺癌预后不良有关。黄卓雅等[10]研究表明OPN在甲状腺癌中呈高表达，与病理分期、分化程度、肿瘤分期、包膜浸润以及颈淋巴结转移有关，与本研究结果相似。

E-钙黏蛋白是常见的细胞表面上皮标记物之一，具有较强的细胞间黏附力，在维持细胞运动和结构的完整性及黏附能力中发挥重要作用。E-钙黏蛋白在正常细胞中呈高表达，而在结直肠癌、乳腺癌、乳头状甲状腺癌等恶性肿瘤中呈低表达。有研究显示E-钙黏蛋白表达降低与结直肠癌分化、浸润、转移以及不良预后有关[11]，其能够促进乳腺癌细胞增殖、浸润、转移，进而促进乳腺癌发展[12]。还有研究认为E-钙黏蛋白低表达与甲状腺乳头状癌的淋巴结转移有关[13]。本研究结果显示，E-钙黏蛋白在甲状腺癌组织中的阳性表达率低于正常甲状腺组织，且E-钙黏蛋白表达情况与包膜浸润、淋巴结转移密切相关(均P<0.05)。这提示E-钙黏蛋白表达降低与甲状腺癌的发生、发展及转移有关。

β-连环蛋白是多功能蛋白质，是连环蛋白家族成员之一，其能够介导细胞间黏附，维持上皮细胞完整性与极性。β-连环蛋白能与E-钙黏蛋白胞质内侧结合，形成E-钙黏蛋白/β-连环蛋白细胞黏附复合体，介导两者之间的细胞相互作用，维持细胞间黏附与运动，进而促进组织结构及形态的发生。有研究表明[14]，β-连环蛋白在肝细胞癌中高表达能够促进癌细胞增殖，与肝细胞癌的转移及包膜形成有关。因此，β-连环蛋白能够促进正常细胞间黏附以及肿瘤细胞的侵袭与转移。本研究结果显示，β-连环蛋白在甲状腺癌组织中的阳性表达率高于正常甲状腺组织，且β-连环蛋白的表达与包膜浸润、淋巴结转移密切相关(均P<0.05)。这提示β-连环蛋白参与甲状腺癌的发展与转移过程。也有研究表明β-连环蛋白在甲状腺癌中呈高表达，在正常组织中呈低表达，在浆液性卵巢癌中β-连环蛋白高表达与癌细胞转移及淋巴细胞转移有关[15-16]，与本研究结果基本一致。

综上所述，甲状腺癌中OPN和β-连环蛋白的表达上调而E-钙黏蛋白的表达下调。OPN、E-钙黏蛋白、β-连环蛋白的表达情况与甲状腺癌的发生、发展、转移及预后不良有关，可作为甲状腺癌早期诊断及预后不良的标记物。