崇明岛大肠杆菌所致社区获得性尿路感染患者特点及产ESBLs菌株的基因型和耐药性特点▲

钱敏健 李星军 陆秀英 曹 萍 秦 云 张 莉

(1 上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科,上海市 202150,电子邮箱：13918656271@139.com；2 同济大学附属上海市第十人民医院崇明分院检验科,上海市 202157；3 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院崇明分院检验科,上海市 202153)

尿路感染是最常见的泌尿系统疾病。全球每年有1亿5千万至2亿5千万尿路感染新发病例[1]。大肠杆菌是社区获得性尿路感染(community acquired urinary tract infection,CA-UTI)最常见的病原菌之一。随着广谱抗菌药物在临床上的广泛应用,耐药大肠杆菌不断增多,特别是产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs )大肠杆菌,往往表现为多重耐药,导致临床治疗陷入较大的困境。由于不同国家和地区抗菌药物使用模式、菌株间耐药性传播方式不同,产ESBLs大肠杆菌流行的型别也有所不同,且不同亚型ESBLs大肠杆菌的耐药谱存在一定差异[2]。崇明岛是中国第三大岛屿,人口约82.15万,目前未见有关崇明岛CA-UTI患者产ESBLs大肠杆菌流行情况的研究报道。本研究通过调查崇明岛大肠杆菌所致CA-UTI的病原体分布特点、产ESBLs大肠杆菌流行的主要基因型别及耐药特点,从而建立流行病学资料,以期有效指导当地临床抗感染治疗,减少多重耐药大肠杆菌的出现及其耐药性传播。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 菌株分离自2016年1～12月崇明岛开展临床微生物培养的三家医院(上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院、同济大学附属上海市第十人民医院崇明分院和上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院崇明分院)的门﹑急诊和入院48 h内确诊的CA-UTI患者的尿液,并剔除同一病例相同部位重复分离的大肠杆菌,分离后保存在甘油/牛肉汤保存液中,储藏于-20℃冰箱内。本研究共收集272株大肠杆菌。尿路感染诊断标准[3]：存在相应的临床症状，尿沉渣白细胞≥10 个/高倍镜视野,清洁中段尿培养病原菌2种及以下且计数≥105CFU/mL。CA-UTI定义：在院外或入院48 h内确诊的尿路感染[3]。以大肠杆菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603为质控菌株,均购于上海市临床检验中心。

1.2 主要仪器与试剂 全自动细菌鉴定仪(西门子公司，MicroScan Walkway 96型),低温高速离心机(Thermo scientific公司，SL16R型),CFX96型PCR扩增仪、PowerPac Basic电泳仪、Bio-Rad ChemiDocTMXRS+凝胶成像仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)。哥伦比亚血琼脂培养基、MH琼脂培养基(上海科玛嘉微生物技术有限公司),药敏纸片(英国Oxiod公司),Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，批号：C805KA3435],2*Es Taq MasterMix(Dye)(康为世纪，批号：CW0690M)，10×PCR缓冲液﹑6×DNA上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司，批号：D7232-4、D0107)。

1.3 检测方法

1.3.1 标本采集：根据《临床微生物学尿培养操作规程》[4]要求,取样前女性用清洗液及灭菌纱布清洗外阴,男性用清洗液清洗尿道口消毒后用无菌尿杯留取清晨首次清洁中段尿,要在抗菌药物使用前或避开抗菌药物使用的血药高峰取样。尿标本采集后应立即送检,不得超过2 h。

1.3.2 药敏试验：取中段尿，离心沉淀后，用10 μL定量接种环垂直伸入尿液标本取沉淀物。先在哥伦比亚血琼脂培养基平板中心线上划线，再在与此线垂直的方向左右连续划线，从上而下完成划线；35℃培养18～24 h，可得到圆形、稍凸、边缘整齐、灰白色、不透明的菌落，采用全自动细菌鉴定仪对尿标本中的细菌菌种进行鉴定。鉴定结果为大肠杆菌后,采用纸片扩散法进行药敏试验,结果参考美国临床和实验室标准协会制订的2016年版《抗菌药物敏感性试验执行标准》[5]进行判断。

1.3.3 大肠杆菌表型确证试验[6]：采用酶抑制剂增强确证试验对大肠杆菌的表型进行鉴定。在涂布大肠杆菌的MH琼脂培养基上贴头孢噻肟(30 μg)与头孢噻肟/克拉维酸(30 μg/10 μg)、头孢他啶(30 μg)与头孢他啶/克拉维酸(30 μg/10 μg)两组纸片,各纸片相距25 mm,35℃孵育18～20 h后取出查看结果。判断标准：两组纸片任意一组后者与前者抑菌环直径之差≥5 mm即判断为ESBLs阳性。

1.3.4 β-内酰胺酶基因型检测：采用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取产ESBLs大肠杆菌的DNA后进行PCR扩增,反应体系为50 μL,具体见表1。各基因引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列和PCR反应参数见表2。所得PCR产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析；电泳时电压120 V,时间30 min；电泳结束后采用凝胶成像系统分析结果。β-内酰胺酶基因分为SHV、TEM、CTX-M型别,根据PCR产物凝胶电泳条带长度判定。采用大肠杆菌ATCC25922(非产ESBLs质控株)作阴性对照,肺炎克雷伯菌ATCC700603(携带blaTEM、blaCTX-M、blaSHV)作阳性对照。PCR扩增产物凝胶电泳结果见图1。

表1 PCR反应体系

表2 下游引物PCR扩增引物序列及其反应参数

A 部分CTX-M型β-内酰胺酶基因PCR扩增产物电泳结果

B 部分TEM型β-内酰胺酶基因PCR扩增产物电泳结果

C 部分SHV型β-内酰胺酶基因PCR扩增产物电泳结果

注：M为2 000 bp DNA Marker；1为阳性对照；2为阴性对照；3～10为标本PCR产物。

1.3.5 β-内酰胺酶基因各型别的测序和序列分析：将上述获得的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序,所测序列结果在BLAST在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中进行序列比对分析。

1.4 数据处理及统计学分析 采用地理信息系统(Geographic Information System,GIS)描述大肠杆菌的空间分布特征。采用世界卫生组织WHONET 5.6软件分析大肠杆菌耐药性分布情况。采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计数资料以例数或百分比表示,组间比较采用χ2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 崇明岛CA-UTIs患者的地区分布 崇明岛CA-UTIs患者主要集中在城桥镇、堡镇、陈家镇和庙镇等地,而新村乡、绿华镇、新海农场、前进农场分布较少，见图2。共检出147株产ESBLs大肠杆菌，病例主要来源于城桥镇、堡镇、陈家镇和庙镇，见表3。

图2 崇明岛CA-UTIs患者的地区分布

注：图中数字为各地区CA-UTIs患者例数占总例数的百分比；未标注数据的地区无发病。

表3 崇明岛不同地区大肠杆菌的检出情况(n)

2.2 不同性别、年龄CA-UTIs患者大肠杆菌检出情况 272株大肠杆菌中,80株来自男性患者,192株来自女性患者。在男性患者中，大肠杆菌主要在41～<91岁患者中检出；其中有49株为产ESBLs大肠杆菌,其主要集中在41～<91岁人群,其余31株非产ESBLs大肠杆菌主要集中在61～<91岁人群。在女性患者中，大肠杆菌也主要在41～<91岁患者中检出；其中有98株为产ESBLs大肠杆菌,其主要集中在41～<91岁人群,其余94株非产ESBLs大肠杆菌主要集中在61～<91岁人群。男性患者的产ESBLs大肠杆菌检出率(61.3%,49/80)高于女性患者(51.0%,98/192),但其差异无统计学意义(χ2=2.369,P=0.123)。见表4。

2.3 大肠杆菌的耐药性检测结果 147株产ESBLs大肠杆菌均未对碳青霉烯类药物亚胺培南和美罗培南产生耐药,对头孢噻肟、头孢呋辛和头孢唑林的耐药率最高,其次是环丙沙星和复方磺胺甲恶唑。125株非产ESBLs大肠杆菌均未对碳青霉烯类药物亚胺培南和美罗培南产生耐药,对环丙沙星的耐药率最高,其次为复方磺胺甲恶唑和头孢唑林。见表5。

表4 不同性别及年龄患者大肠杆菌检出情况(n)

表5 大肠杆菌的耐药性检测结果

续表5

2.4 产ESBLs大肠杆菌的基因型检测结果 147株产ESBLs大肠埃希菌中,123株获得基因分型,其中CTX-M型菌株115株(93.5%),SHV型菌株12株(9.8%),TEM型菌株96株(78.0%)；有24株产ESBLs大肠杆菌未获得基因分型。

2.5 123株获得基因分型的产ESBLs大肠杆菌的基因测序结果 结果显示,CTX-M型菌株耐药基因的序列为CTX-M-14(45.2%,52/115)和CTX-M-15(54.8%,63/115)；TEM型菌株耐药基因的序列均为TEM-1。有79.7%(98/123)产ESBLs大肠杆菌携带2种耐药基因,有1株产ESBLs大肠杆菌同时携带3种耐药基因。见表6。

2.6 不同基因型产ESBLs大肠杆菌的耐药性比较 3种基因型产ESBLs大肠杆菌对头孢噻肟、头孢呋辛和头孢唑林等头孢菌素类抗菌药物的耐药率均为100.0%,对环丙沙星的耐药率也较高。不同基因型产ESBLs大肠杆菌对抗菌药物的耐药率差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表7。

表6 123株获得基因分型的产ESBLs大肠杆菌的基因测序结果

表7 不同基因型产ESBLs大肠杆菌的耐药性比较

3 讨 论

崇明岛CA-UTI患者主要集中在城桥镇(13.2%)、堡镇(10.7%)和陈家镇(9.9%)等地,新村乡(3.3%)、绿华镇(2.9%)、新海农场(2.9%)、前进农场(2.9%)等地分布较少；产ESBLs大肠杆菌主要分布在来自城桥镇、堡镇、陈家镇和庙镇的患者,在新海农场和前进农场的患者中未发现产ESBLs大肠杆菌。造成这种分布差异的原因可能是产ESBLs的菌株可以通过结合、转化、转导等形成耐药基因在细菌间扩散[7]，而城桥镇、堡镇、陈家镇是崇明岛的三大镇,人口较密集,这种环境下有助于耐药基因在细菌间扩散。本研究结果显示,大肠杆菌所致的CA-UTI患者以女性为主,女性患者的产ESBLs大肠杆菌检出率高于男性,但差异无统计学意义(P>0.05)；无论在男性还是女性CA-UTI患者中,大肠杆菌均主要在41～<91岁患者中检出,尤以61～<91岁人群最为集中。以上说明大肠杆菌更易在老年女性尿道定植,与罗马尼亚布加勒斯特地区的调查结果相似[8],其主要原因是高龄所致的下尿路功能减退,以及泌尿生殖系统萎缩引起的生殖道菌群失调等[9]。

产ESBLs大肠杆菌往往表现为多重耐药,可导致反复性、难治性尿路感染发生,这不仅给临床治疗带来困难,也增加了患者的经济负担。因此,了解大肠杆菌的耐药性特点,可为临床合理用药、减少多重耐药菌株的产生提供依据。本研究结果显示,分离自CA-UTI患者的大肠杆菌,无论产ESBLs与否,均未对碳青霉烯类抗菌药物亚胺培南和美罗培南耐药,而对哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦等β-内酰胺酶抑制剂、呋喃妥因、阿米卡星和磷霉素的耐药率均较低,与耿丽颖[10]的研究结果相似。因此在治疗本地区大肠杆菌导致的尿路感染时,上述这些抗菌药物可作为经验选择药物。本研究结果显示,产ESBLs菌株对头孢噻肟、头孢呋辛和头孢唑林的耐药率最高,其次是环丙沙星、复方磺胺甲恶唑和庆大霉素,而非产ESBLs菌株对环丙沙星、复方磺胺甲噁唑的耐药率最高,提示产ESBLs菌株对第一、二、三代头孢菌素类药物均耐药。此外，产ESBLs或非产ESBLs菌株均对氟喹诺酮类、磺胺类和氨基糖苷类(除阿米卡星)等药物多重耐药。因此,在治疗崇明岛大肠杆菌引起的CA-UTI患者时,不建议将环丙沙星和复方磺胺甲恶唑作为经验用药,而应将患者尿液标本送检,参考微生物实验室提供的体外药敏试验结果选择用药。

在本研究获得基因型分型的123株产ESBLs大肠杆菌中,CTX-M型菌株检出率为93.5%,低于国内其他研究结果(100%)[11],但高于印度的研究结果(70.2%)[12]。这说明不同国家和地区流行的基因型不同,可能与不同地区大肠杆菌携带的ESBLs基因耐药质粒不同有关。SHV在欧美国家检出率高,在中国低,多见于重症的院内感染,社区感染较少,仅占3.0%[13]。在本研究中，SHV的检出率为9.8%,稍高于上述结果。本研究中CTX-M型大肠杆菌的基因型主要为CTX-M-14和CTX-M-15,其耐药特点为：未对碳青霉烯类抗菌药物亚胺培南和美罗培南产生耐药,对哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦等β-内酰胺酶抑制剂的耐药率较低,对头孢噻肟、头孢呋辛、头孢唑林等头孢菌素类抗菌药物耐药率最高,对环丙沙星耐药率较高。因此，在崇明岛治疗此型产ESBLs大肠杆菌引起的CA-UTI时，可使用碳青霉烯类和β-内酰胺酶抑制剂等抗菌药物。

流行病学研究表明,CTX-M基因正在取代SHV和TEM成为最常见的ESBL基因[14-16]。而CTX-M耐药基因的传播可能与其周围基因元件有关,位于CTX-M基因上游的IEScp基因可能对耐药基因的传播起重要作用[17]。本研究结果显示,CTX-M型产ESBLs大肠杆菌耐药基因的序列为CTX-M-14和CTX-M-15,与针对广东湛江地区的研究结果[18]不尽相同,这可能与不同地区经验用药种类不同导致细菌耐药基因突变或产生选择性细菌耐药株不同有关。此外，本研究中有79.7%产ESBLs大肠埃希菌携带2种耐药基因,高于浙江宁波地区的研究结果[13]。

综上所述,崇明岛大肠杆菌所致CA-UTI患者主要分布于城桥镇、堡镇和陈家镇,女性患者多于男性；CTX-M-14、CTX-M-15、TEM-1型是产ESBLs大肠杆菌的主要基因型。在该地区治疗由大肠杆菌引起的CA-UTI患者时,不建议用氟喹诺酮类和磺胺类抗菌药物作为临床经验用药；建议临床医生送检患者尿液标本做细菌培养结合耐药株的耐药基因检测,合理使用抗生素,以控制多重耐药大肠杆菌的发生和传播。