急性缺血性脑卒中患者血清LncRNACAI2表达水平及临床意义▲

洪春永 林进皇 林庆金 李清金 韩玉惠 江 华 吴欣宇 卢武生

(中国人民解放军联勤保障部队第九〇九医院暨厦门大学附属东南医院神经内科，福建省漳州市 363000，电子邮箱：1401845754@qq.com)

缺血性脑卒中通常是指因脑的供血动脉(颈动脉或椎动脉系统)狭窄或闭塞引起血液循环障碍、缺血、缺氧所致的局部脑组织缺血性坏死的总称，发病后2周内定义为急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)。AIS是脑卒中最常见的类型，占脑卒中的69.6%～70.8%[1]。由于AIS具有高致死性、高致残率、预后不佳的特点，早期AIS的血液学标志物对其早诊断、早治疗、早康复和预防再发具有重要的临床意义和应用价值[1-2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，参与多种病理生理机制，例如脑缺血损伤、神经退行性疾病、神经生长发育等，在神经系统发育和功能中起重要作用。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A/可变读框基因内含子2(cycling-dependent kinase inhibitor 2A/alternative reading frame Intron 2,CAI2)长链非编码RNA位于9号染色体，是单外显子、多腺苷酸化基因，对9p21的两个重要抑癌基因p16、可变读框基因有调控作用[3]。有关LncRNA CAI2在AIS中作用机制的研究鲜见报告。 本研究检测AIS患者血清中LncRNA CAI2的表达水平及其在AIS中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2015年1月至2018年10月在我科治疗的26例AIS患者(AIS组)的临床资料。纳入标准：(1)符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[1]中关于AIS的诊断标准，并经头颅CT和(或)MRI证实；(2)均为首次急性发病，发病至就诊时间在24 h内，病程为2～14 d。排除标准：(1)机体存在感染灶或入院前1周内有感染史；(2)严重肝肾功能不全；(3)合并脑出血；(4)心脏瓣膜病、心房颤动等导致的心源性栓塞；(5)腔隙性脑梗死。另选取同期在我院门诊体检的26名健康者作为对照组。其中AIS组男性14例，女性12例；年龄50～67(55.0±6.7)岁，对照组男性14例，女性12例；年龄 49～66(54.0±5.7)岁。两组研究对象的性别、年龄差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究符合本院伦理委员会要求，研究对象均知情同意。

1.2 方法 取AIS患者发病48 h内、对照组体检当日的静脉血3 mL，枸橼酸钠抗凝，5 000 r/min离心20 min取血清，置于-80℃液氮中保存待测。提取总RNA后，采用实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法测定血清LncRNA CAI2水平，具体步骤：(1)采用High Capacity cDNA reverse transcription kit逆转录试剂盒(Applied Biosystems,USA，批号：A257414368813)将总RNA逆转录为cDNA，逆转录反应体系为20 μL，包括10 μL 200 ng/μL RNA、2.0 μL 10×RT Buffer、0.8 μL 25×dNTP Mix(100 mM)、2.0 μL 10×RT随机引物、1.0 μL MultiScribeTM逆转录酶、4.2 μL不含核酸酶H2O；反应条件为25℃，10 min;37℃,120 min;85℃,5 min。(2)采用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix试剂(Applied Biosystems,USA，批号：A25741)对cDNA进行扩增，反应体系为10 μL，包括5 μL PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(2×)，0.5 μL上游引物(500 nM)、0.5 μL下游引物(500 nM)、4 μL cDNA+不含核酸酶H2O。反应条件为95℃ 2 min，95℃ 15 s(40个循环)，60℃ 30 s。采用CFX ConnectTM荧光定量PCR检测系统(BIO-RAD公司，USA)进行实时定量PCR，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参，引物序列见表1。PCR扩增完成后，以GAPDH为内参，采用2-△△CT法，计数LncRNA CAI2的相对表达量。

表1 引物序列

以AIS患者LncRNA CAI2表达水平的中位数为基准将AIS患者分为LncRNA CAI2低表达组和高表达组。以梗死灶CT表现(病灶大小和个数)作为分型标准[4]，将脑梗死分为大梗死、中梗死、小梗死、腔隙性梗死、多发性梗死。根据美国国立卫生研究院卒中量表(the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)的评分标准，将梗死程度分为轻、中、重度[5-7]。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数(百分比)表示，比较采用确切概率法；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评估LncRNA CAI2表达水平诊断AIS的敏感度和特异度。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组研究对象血清LncRNA CAI2表达水平比较 AIS组LncRNA CAI2表达水平为(1.505±0.050)，对照组为(1.147±0.054)，AIS组LncRNA CAI2表达水平高于对照组(t=24.805，P<0.001)。

2.2 AIS患者血清LncRNA CAI2表达水平与临床特征的关系 LncRNA CAI2表达水平与梗死程度相关(P<0.05)，而与性别、年龄、梗死分型、高血压、吸烟史、血糖水平未见相关，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

表2 AIS患者血清LncRNACAI2表达水平与临床病理参数的关系(n)

2.3 血清LncRNA CAI2水平对AIS的诊断价值 ROC结果显示，血清LncRNA CAI2水平诊断AIS的曲线下面积为0.826，95%CI为0.716～0.936；最佳截断值为0.500时，其敏感度为65.4%，特异度为84.6%，见图1。

图1 血清LncRNA CAI2诊断AIS的ROC曲线

3 讨 论

AIS是临床最常见的脑血管疾病之一，常伴随着神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞损伤[8-9]。AIS具体病因未明，发病机制复杂，严重威胁中老年人身心健康。近年来，AIS患病率呈逐年上升的趋势,且致残率和致死率均较高[10-11]，给社会和家庭带来沉重负担。

LncRNA在脑组织中广泛表达，在脑缺血和卒中康复中具有重要作用，可通过神经兴奋毒性、氧化应激、神经炎症反应、凋亡等病理机制引起AIS患者大脑二次损伤，阻碍患者神经功能康复，但具体机制尚未完全清楚[12-13]。有研究发现，AIS患者LncRNA ANRIL表达下调与脑卒中风险、疾病严重程度、炎症反应成正相关[14]。还有学者发现，linc-DHFRL1-4、SNHG15、linc-FAM98A-3等LncRNA在AIS患者中的表达水平高于健康人和短暂性脑缺血发作患者，某些LncRNA如SNHG15、linc-FAM98A-3可作为诊断AIS的标志物[15]。CAI2在正常组织中低表达，在多种肿瘤细胞均有高表达[3]，但其在AIS中的作用鲜见报道。本研究结果显示，AIS组患者LncRNA CAI2表达水平高于对照组，且其表达水平与梗死程度相关(均P<0.05)，提示AIS患者血清LncRNA CAI2表达水平升高，LncRNA CAI2与患者疾病的严重程度有一定相关性，可能参与AIS的发展。

本研究ROC结果显示，血清LncRNA CAI2水平诊断AIS的曲线下面积为0.826，95%CI为0.716～0.936；当取临界值为0.500时，其敏感度为65.4%，特异度为84.6%。这提示血清LncRNA CAI2的表达水平对于 AIS 的诊断具有一定的指导价值。但目前关于LncRNA的研究仍处于起步阶段，其相关的分子机制未阐明，而且很多LncRNA只在灵长类动物中表达，这给LncRNA的研究带来一定困难。

综上所述，AIS患者血清LncRNA CAI2水平升高，其或可成为早期诊断AIS的一种潜在生物学标志物。但本研究样本例数较少，且为回顾性研究，可能存在一定的偏倚，相关结果有待更多前瞻性、大样本的随机临床试验来验证。