高效毕赤酵母表达载体的改造与应用

2019-02-19侯增淼李晓颖杨小琳赵金礼

生物学杂志 2019年1期

侯增淼,李晓颖,高恩,杨小琳,赵金礼

(陕西慧康生物科技有限责任公司，西安 710054)

随着生物技术的发展，利用基因工程技术来开发重组蛋白已颇受人们青睐。毕赤酵母表达系统是当前流行的真核表达系统之一[1]，具有许多其他蛋白表达系统所不具备的优点，有可诱导的强启动子，外源基因能整合于染色体上，具有高表达、高稳定、高密度发酵、适度糖基化、表达产物生物活性好、发酵纯化操作方法简便及易于工业化生产等特点，已成功地表达了许多极具价值的蛋白[2]。但是不同的蛋白在毕赤酵母表达过程中表现出不同的表达量，有的蛋白难以在毕赤酵母中表达，而有的蛋白表达量可达10 g/L以上[3]，因此，分泌表达量成为制约毕赤酵母表达的瓶颈，如何提高产量，降低生产成本，是目前的研究热点。有研究发现，外源蛋白在毕赤酵母表达过程中易在内质网中滞留无法分泌至胞外，从而导致表达量较低[4]，因此外源蛋白在内质网中的无法正确折叠和整合严重影响外源蛋白的产率。利用共表达分子伴侣如蛋白二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase,PDI)能够有效改善这一状况[5-6]，使外源蛋白的分泌效率有效提高。另外，外源蛋白在表达过程中的降解也是影响分泌表达量的一个重要因素，YPS1蛋白酶是一类糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的天冬氨酸蛋白酶，能特异性地切割底物中的单或双碱性氨基酸残基位点[7]，易使外源蛋白在表达过程中降解，在人血清白蛋白(HSA)、明胶(Gelatin)和胰高血糖素(Glucagon)等蛋白的表达过程中，通过对YPS1基因的失活，与野生型酵母中的表达水平相比，减少了目的蛋白在表达过程中的降解，从而有效提高表达量[8-9]。

本文以毕赤酵母pPICZαA为骨架载体，在特定位点插入PDI表达盒和YPS1基因C端和N端非功能区序列，可在同一载体中实现外源基因与二硫键异构酶共表达，同时失活YPS1基因，为提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达量提供一种高效载体。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及试剂PichiapastorisGS115、pPICZaA购自Invitrogen公司；E.coliDH5α、TaqDNA聚合酶、PFU高保真酶、EsayGeno快速重组克隆试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提取试剂盒、酵母基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化；SolutionⅠ购自Takara公司；碱性磷酸酶(CIP)购自NEB公司；限制性内切酶均购自Thermo公司；SYBR Premix ExTaqTMII购自Takara公司；GeneRuler DNA Ladder Mix、GeneRuler DNA Ladder Mix、Unstained Protein Molecular Weight Marker 26610、PageRuler Unstained Low Range Protein Ladder 26632均购自Thermo公司；pPICZαA-HSA、pPICZαA-hGH表达载体为本公司构建。

1.1.2 主要仪器 PCR仪(DNA Engine，BIO-RAD)；电转仪(BIO-RAD)；LightCycler® 96实时荧光PCR仪(Roche)；5 L发酵罐系统(上海保兴)；凝胶成像分析仪(WD-9413B，北京六一)；DNA电泳系统(北京六一)；蛋白电泳系统(北京六一)。

1.2 方法

1.2.1YPS1基因失活载体pPICZαA-YPSΔ构建

以插入pPICZαA原始载体的BamH I位点区为目的，按照EasyGeno无缝克隆要求设计失活YPS1蛋白酶的C端和N端非功能区序列引物，缺失YPS1基因的功能区，在C端序列和N端序列之间添加EcoR I酶切位点GAATTC(最终表达载体线性化位点)，C端非功能区序列引物为YPS-C-F/YPS-C-R，N端非功能区序列引物为YPS-N-F/YPS-N-R，引物序列见表1。

以毕赤酵母基因组DNA为模板，分别以YPS-C-F和YPS-C-R、YPS-N-F和YPS-N-R为引物，利用高保真酶PCR获得YPS1基因N端和C端基因序列。另外，对pPICZαA原始载体进行BamH I单酶切，并对酶切产物进行碱性磷酸酶去磷酸化，然后利用天根生化EasyGeno无缝克隆技术快速将上述获得的YPS1基因C端序列和N端序列同时克隆连接至pPICZαA载体的BamH I位点处，转化DH5α感受态细胞，酶切及测序鉴定。

1.2.2PDI表达盒的获得

按照毕赤酵母二硫键异构酶(PDI)序列设计PDI序列引物PDI-bspU/PDI-xbaL，序列见表1，在上游引物添加Bsp119 I限制性内切酶位点，下游引物添加XbaI限制性内切酶位点，经PCR获得PDI基因片段后，再经Bsp119 I和XbaI双酶切，连接至pPICZαA原始表达载体中，转化大肠杆菌DH5α，构建pPICZαA-PDI。

以获得的pPICZαA-PDI载体为模板，以插入pPICZαA-YPSΔ载体的BglII位点区为目的，设计EasyGeno无缝克隆引物PDI-EG-F/PDI-EG-R，序列见表1，利用高保真酶进行PCR，PCR产物为PDI表达盒，包括AOX启动子、PDI序列和AOX1转录终止区。

1.2.3 高效表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ的构建

对上述获得的pPICZαA-YPSΔ进行BglII单酶切，利用碱性磷酸酶进行去磷酸化，然后利用天根生化EasyGeno无缝克隆技术快速将上述获得的PDI表达盒连接至pPICZαA-YPSΔ载体的BglII位点处，转化大肠杆菌DH5α，酶切及测序鉴定构建结果。

1.2.4 外源蛋白表达菌株的构建

1)人血清白蛋白表达菌株构建。根据人血清白蛋白(HSA)的基因序列设计引物HSA-XU/HSA-NL，序列见表1。在上游引物中添加XhoI 酶切位点CTCGAG，同时在XhoI酶切位点后添加AAAAGA，可在表达过程中经KEX2酶切割，获得天然N端目的蛋白；在下游引物中添加NotI限制性酶切位点GCGGCCGC。以人皮肤组织cDNA为模板，经PCR获得HSA基因后，与高效表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ同时进行XhoI和NotI双酶切，回收纯化酶切产物，再将HSA与pPICZαA-PDI-YPSΔ载体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA表达载体，然后将pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA表达载体经EcoR I内切酶线性化后电转化毕赤酵母GS115，同时将本公司利用pPICZαA原始载体构建的HSA表达载体pPICZαA-HSA以相同条件电转化毕赤酵母GS115，zeocin筛选高拷贝菌株GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA。

2)人生长激素表达菌株构建。根据人生长激素(hGH)的基因序列设计引物hGH-XU/hGH-NL，序列见表1。GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH表达菌株构建过程同1.2.4中(1)，同时与本公司构建的pPICZαA-hGH以相同条件转化毕赤酵母GS115，zeocin筛选。

1.2.5 外源蛋白表达的检测

1)相同质粒拷贝数菌株筛选及表达结果检测。以毕赤酵母中高度保守基因三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)为内参基因，利用酵母基因组DNA提取试剂盒提取构建的含有外源基因HSA/hGH的毕赤酵母菌株基因组DNA，以表1中Qgapdh-F/Qgapdh-R、Qhsa-F/Qhsa-R和Qhgh-F/Qhgh-R为引物进行实时荧光定量PCR检测，通过2-△△Ct法相对定量GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA、GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH和GS115/pPICZαA-hGH各菌株基因拷贝数，分析扩增产物溶解曲线，以确保特异性扩增，然后选取相同质粒拷贝数的菌株进行摇瓶和发酵罐发酵，SDS-PAGE电泳检测表达情况，利用高效液相色谱外标法测定HSA和hGH的表达量。

2)PDI过表达的检测。以毕赤酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)为内参基因，提取GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA、GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH和GS115/pPICZαA-hGH发酵后菌株基因组DNA，以表1中Qgapdh-F/Qgapdh-R和Qpdi-F/Qpdi-R为引物进行荧光实时定量PCR检测PDI基因的表达。

3)YPS1基因失活检测。以YPS1基因的功能区为模板，设计检测引物YPS-F/YPS-R，以筛选获得的菌株GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA、GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH和GS115/pPICZαA-hGH基因组DNA为模板，利用检测引物进行PCR，检测YPS1基因的缺失与否。

2 结果

2.1 YPS1基因失活载体pPICZαA-YPSΔ构建

以pPICZαA为骨架载体，PCR获得YPS1基因C端和N端非功能区序列，利用EasyGeno无缝克隆技术将YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体的BamH I位点处，然后用BamH I酶切及测序鉴定连接结果，酶切鉴定结果(见图1)显示，构建的pPICZαA-YPSΔ经BamH I酶切后可切出约1100 bp大小片段，与预期相符。

表1 设计的引物序列Table 1 Design of primer sequences

1：pPICZαA-YPSΔ质粒；2：pPICZαA-YPSΔ酶切结果；M：DNA Marker

图1 pPICZαA-YPSΔ酶切鉴定结果
Figure 1 Analysis of pPICZαA-YPSΔ digested byBamH I

2.2 高效表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ的构建

将毕赤酵母二硫键异构酶基因(PDI)连接至pPICZαA，再经PCR扩增获得PDI表达盒，PCR结果见图2-A，扩增出2900 bp大小片段，与预期相符，然后将PDI表达盒利用天根生化EasyGeno无缝克隆技术连接至pPICZαA-YPSΔ载体的BglII位点处，用BglII酶切及测序鉴定连接结果，酶切鉴定结果见图2-B，获得正确连接的pPICZαA-PDI-YPSΔ高效表达载体，pPICZαA-PDI-YPSΔ质粒图谱见图3。

A：PDI表达盒PCR结果(1、2为平行样)；B：pPICZαA-PDI-YPSΔ酶切结果

图2 PDI表达盒和pPICZαA-PDI-YPSΔ酶切结果
Figure 2 PDI expression cassette and analysis of pPICZαA-PDI-YPSΔ digested byBglII

图3 pPICZαA-PDI-YPSΔ质粒图谱Figure 3 The plasmid profile of pPICZαA-PDI-YPSΔ

2.3 人血清白蛋白的表达

2.3.1 相同质粒拷贝数菌株筛选及表达结果检测

以GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA菌株基因组DNA为模板，以GAPDH基因为内参，使用荧光实时定量PCR仪，对GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA菌株HSA基因拷贝数进行比较，HSA和GAPDH基因溶解曲线(见图4)显示无特异性扩增。然后选取拷贝数相同的菌株进行摇瓶及发酵罐发酵，SDS-PAGE电泳检测结果显示，GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA较GS115/pPICZαA-HSA表达量明显提高，表达结果见图5(摇瓶上清液与上样缓冲液等体积混合，取10 μL上样)。对两种菌株在同一条件下经发酵罐发酵检测(pH 5.5，温度28℃)，利用高效液相色谱外标法测定HSA的表达量，GS115/pPICZαA-HSA表达量约1 g/L，而GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA表达量可达到6 g/L，较改造前提高了6倍，结果见图6(发酵上清液稀释10倍后与上样缓冲液等体积混合，10 μL上样)。

图4 GAPDH、HSA和hGH溶解曲线Figure 4 The amplification curves of GAPDH,HSA and hGH

1、2：GS115/pPICZαA-HSA；3、4、5：GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA

图5 HSA摇瓶发酵电泳结果
Figure 5 Shake flask fermentation results of HSA

F1：GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA；F2：GS115/pPICZαA-HSA

图6 HSA发酵罐发酵不同时间取样电泳结果
Figure 6 Electrophoresis results of HSA fermentation at different time

2.3.2PDI过表达的检测

以GAPDH基因作为内参基因，利用荧光实时定量PCR分别检测2.3.1中发酵罐发酵后两种菌株菌体DNA中PDI基因的表达，利用2-△△Ct法，对GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA菌株PDI基因表达进行比较，利用LightCycler® 96实时荧光PCR仪系统软件作图，结果见图7，GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA菌株中PDI基因表达量明显高于GS115/pPICZαA-HSA菌株。

2.3.3YPS1基因失活检测

当pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA质粒线性化后转化毕赤酵母，质粒两端的YPS1基因N端序列和C端序列与GS115基因组YPS1基因两端进行置换，从而使外源基因同源重组整合到酵母基因组DNA，同时缺失基因组YPS1基因功能区序列，失活过程见图8-A。对于上述GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA和GS115/pPICZαA-HSA菌株，利用YPS1基因功能区扩增引物YPS-F/YPS-R扩增YPS1基因功能区片段，从图8-B可以看出，GS115/pPICZαA-HSA可以扩增出目的条带，说明YPS1基因功能区完整，而GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA以相同PCR条件未扩增出目的条带，说明YPS1基因功能区已缺失。

图7 Real-time PCR检测PDI基因在不同菌株中的表达Figure 7 Detection of PDI gene expression in different strains by Real-time PCR

A：YPS1基因失活过程；B：YPS1基因PCR检测(1: GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-HSA,2:GS115/pPICZαA-HSA)

图8YPS1基因失活过程和PCR检测
Figure 8 Deletion process and PCR detection ofYPS1 gene

1、2：GS115/pPICZαA-hGH；3、4、5、6：GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH

图9 hGH摇瓶发酵电泳结果
Figure 9 Shake flask fermentation results of hGH

2.4 人生长激素的表达

参考2.3.1，选取拷贝数相同的菌株进行摇瓶及发酵罐发酵。SDS-PAGE电泳鉴定结果显示，GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH较GS115/pPICZαA-hGH表达量明显提高，结果见图9(摇瓶上清液与上样缓冲液等体积混合，沸水煮5 min，取20 μL上样)。另外，对两种菌株在同一条件下经发酵罐发酵检测(pH 4.5，温度29℃)，利用高效液相色谱外标法测定hGH的表达量，GS115/pPICZαA-hGH表达量约50 mg/L，而GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH表达量可达到200 mg/L，较改造前提高了约4倍，结果见图10(PDI表达和YPS1缺失检测结果同上述2.3.2、2.3.3)。

F1：GS115/pPICZαA-hGH；F2：GS115/pPICZαA-PDI-YPSΔ-hGH

图10 hGH发酵罐发酵不同时间取样电泳结果
Figure 10 Electrophoresis results of hGH fermentation at different times

3 讨论

毕赤酵母表达系统中外源蛋白的分泌表达是一个复杂连续的过程，很多因素均能影响其表达量，其中包括外源基因密码子的优化、提高基因的拷贝数、分泌信号的改造等方法[2]。在以往研究中，通过增加基因的拷贝数来提高表达量是一种有效的手段，在一些蛋白的表达中已得到应用，但是，某些蛋白的表达量并不是一直随着基因拷贝数的增加而增加[10-11]，当蛋白大量表达时，易造成蛋白在内质网中错误折叠和积累，而错误折叠的蛋白被禁止离开内质网或被降解清除，这就产生了外源蛋白分泌的瓶颈。另外，毕赤酵母发酵周期较长，在发酵过程中酵母自身会分泌大量的蛋白酶，这些蛋白酶会特异性识别外源蛋白序列，从而使外源蛋白降解。

鉴于以上原因，我们利用二硫键异构酶催化蛋白二硫键的形成及抑制错误折叠蛋白聚集的分子伴侣活性[12]，同时失活蛋白酶YPS1抑制外源蛋白降解，通过二者的联合作用，达到提高外源蛋白表达量的目的。目前，在同一毕赤酵母菌株中共表达外源目的蛋白和分子伴侣二硫键异构酶(PDI)，或失活YPS1基因，常规方法为分别构建不同的载体，包括外源蛋白表达载体、过表达二硫键异构酶载体和YPS1失活载体，Wang等[13]共表达伴侣蛋白PDI、BiP和HAC1以提高蝎毒活性肽BmK AngM1的表达，其中BmK AngM1肽采用pPIC9K载体表达，而伴侣蛋白PDI、BiP和HAC1采用pPICZ-A载体进行表达；Yao等[14]利用YPS1基因失活减少HSA-AX15蛋白的降解，HSA-AX15采用pPIC9K载体表达，而YPS1基因失活采用pPICαA载体来实现。

分析上述采用方法，构建不同载体分别进行转化筛选，过程繁琐复杂，还需考虑采用不同的筛选标记，筛选周期长，难度较大，因此，我们对毕赤酵母常用表达载体pPICZαA进行改造，在同一载体实现外源蛋白和二硫键异构酶共表达并失活蛋白酶YPS1基因的方法，同时，在载体转化过程中，以YPS1基因的C端和N端非功能区之间的EcoR I酶切位点作为线性化位点，线性化后以YPS1的C端和N端序列作为同源臂同源重组插入毕赤酵母基因组，让该载体更易于操作。