外泌体作为前列腺癌肿瘤标志物的研究新进展

方建雄 刘久敏 蒲小勇

现阶段前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性最常见的恶性肿瘤之一，在欧美男性中其发病率排名第一，死亡率排名第二[1]。我国PCa的发病率及死亡率均较世界平均水平低[2]，这一方面与人种因素及生活条件等有关，另一方面可能是因为西方国家PCa的筛查机制、体检制度较完善，容易发现更多早期PCa患者[1]。由于我国人口基数大，且近年来人口老龄化问题严重，我国PCa的发病率较之前明显上升。2016年中国肿瘤登记中心收集的数据显示，2013年我国PCa新发病例约6万例，在男性恶性肿瘤发病率中排名第六位，在城市男性恶性肿瘤中排名也是位居第六，与2012年肿瘤登记数据相比上升明显[3]。这表明，随着我国老龄人口的增多，PCa已经成为严重影响我国男性健康的泌尿系恶性肿瘤。

虽然已经研究开发出了许多已证实具有生存获益的新型疗法，但其对PCa患者生存率的提高仍微不足道。临床上PSA常用作PCa检测的生物标记，被广泛用于治疗选择、疗效观察和临床随访的决策中。而Gleason组织病理学评分被用作PCa的重要预后指标。尽管PSA及Gleason评分应用广泛，但其作为一种筛查和预后评估工具，表现并不理想，因缺乏特异性，PSA并不能可靠地区分癌症与良性前列腺疾病，其在预测疾病和治疗方面准确性欠佳。因此需要开发新的生物标记来满足这些临床需求。近年来许多研究都指出外泌体是PCa的一种潜在的肿瘤标志物，外泌体未来作为PCa的预后因素的前景也被看好。本文对以外泌体作为PCa肿瘤标志物的相关研究成果以及研究前景进行了分析和总结，综述如下。

一、前列腺外泌体简介

1.外泌体的起源、组成和保存：1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。人体大多数类型细胞都能分泌外泌体，它是一种小(30～150 nm)双脂膜囊泡，包含具有特异性质的蛋白质、脂质和核酸[4]。蛋白质为外泌体内容物的主要成分，参与外泌体的结构形成、膜转运及融合、抗原呈递及肿瘤发生和发展等过程。外泌体能携带大量核酸，其脂质双分子层结构可避免核酸被降解，并将核酸转运到特定靶细胞发挥重要的调控作用。目前，关于外泌体内携带的核酸，相关研究[4]发现两种已知的PCa核酸生物标记，PCa抗原3(PCA3)和TMPRSS2-ERG融合基因，可以在从PCa患者尿液中分离出来的外泌体中检测出来。且越来越多的证据表明，在体液中循环的微小RNA(microRNA,miRNA)也存在于外泌体中[5]。此外，不同的亲代细胞产生的外泌体其内容物有显著差异，亲代细胞所处的不同的生理状态对于外泌体内容物的生化性质也有显著的影响[6]。由前列腺组织分泌的外泌体也有类似的特点，其分布十分广泛，目前可以通过非侵入性手段在血液、尿液以及精液中检测到，且其在体液中非常稳定，所以外泌体被认为是目前PCa肿瘤标志物研究中很有前景的一个方向。

2.外泌体的分离与提取：关于外泌体的分离与提纯，目前还没有一种方法可以经济有效地获取高度纯净且具有良好特征的外泌体。传统的外泌体提取方法主要包括：①超速离心法[7-8]，这是目前外泌体提取最常用的方法。这种方法是由多个离心步骤组成，通过提高速度连续离心来消除大量死细胞和大细胞碎片，使用时将沉淀物丢弃，并将上清液用于以上步骤，以顺序分离出沉淀细胞(300 g)及微泡(10 000 g)等，然后将最终的上清液以100 000×g超速离心以沉淀与外泌体相对应的小囊泡。最后以大量磷酸缓冲盐溶液洗涤沉淀物，除去污染的蛋白质，并以相同的速度离心最后一次。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，不能很好地区分提纯微泡及外泌体。②过滤离心法[4]，这种方法操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但提取到的外泌体纯度甚至不如超速离心法，现在已少用。③密度梯度离心法[9]，基于密度梯度的隔离,使用蔗糖或碘克沙醇，用这种方法可以提取到高纯度的外泌体，但是制备工序繁杂，耗时，一般用于实验室对外泌体的提存研究，目前难以应用于临床检测。

针对以上问题，新的外泌体检测技术被不断地开发并应用于临床和实验室检测。如免疫磁珠法[10]，或者以此为基础的PS(磷脂酰丝氨酸)亲和法[11]，即使用Tim4蛋白以特异性地结合细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)表面上显示的磷脂酰丝氨酸。因为这种结合是Ca2+依赖性的，通过添加Ca2+螯合剂可以很容易地从Tim4释放完整的EVs。研究发现，这种方法获得的外泌体形态完整，纯度最高，不会影响外泌体的生物活性；相比传统方法，使用Tim4蛋白纯化能够获得更高纯度的EVs。制备高纯度的EVs对于后续的质谱法检测EVs特异性蛋白质有重要的意义，有利于更好地表征和定量不同的EVs群体的蛋白质组。此外，也有一些用于外泌体分离提存的商业试剂盒，包括沉淀溶液[12]，例如ExoQuick或Total Exosome Isolation试剂盒[7,13-14]，以及柱基的测定，例如exoRNeasy血清/等离子体。

3.外泌体的作用与作用机制：外泌体在1980年刚被发现时，被认为其作用单一，主要参与细胞排泄废物的过程。如今大量关于外泌体生物来源、信号传导通路甚至其在体液中的分布差异等研究相继开展，发现外泌体具多方面的功能。它在生理进展过程中的具体功能主要取决于其所来源的细胞类型，不同细胞产生的外泌体由不同的成分组成，携带了不同的生物信息。如肿瘤细胞产生的外泌体在肿瘤的发生、发展中有重要作用，它甚至直接促进肿瘤的侵袭、转移、耐药和免疫逃逸。有研究表明肿瘤来源的外泌体参与肿瘤细胞与基底细胞遗传信息的交换，改变肿瘤生长的微环境，从而导致大量新生血管的生成，为促进肿瘤的生长与侵袭创造了有利的条件[6,15-16]。Hashimoto等[17]对几种人类癌细胞系分泌的外泌体miRNA进行了全面的表达分析，并鉴定了其中8种类型的人类miRNA，这些来源于肿瘤细胞外泌体的miRNA在成骨细胞表型诱导PCa细胞系的外泌体中高表达。其中的一种miRNA，即hsa-miR-940，通过靶向ARHGAP1和FAM134A，在体外可以显著促进人间充质干细胞的成骨分化。研究表明，从癌细胞衍生的外泌体是细胞间的动态的微型工厂，它积极地促进疾病特别是肿瘤的进展[18]。

关于外泌体的作用机制，目前主要有两种观点：①外泌体膜蛋白或经过修饰的外泌体外膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合，进而激活靶细胞细胞内的信号通路。如Webber等[6]的研究认为，人体内TGFb1蛋白的某些片段与癌细胞分泌的细胞外纳米囊泡即外泌体相关，并且提出了可溶的囊泡TGFb1在基质激活过程中的重要性，而肌成纤维细胞富集基质的激活是癌症进展必不可少的限速步骤。更有趣的是，该研究使用非外泌体形式下的可溶性TGFb1则不能促进肿瘤血管生成或肿瘤组织的增大，这进一步说明了外泌体在肿瘤发展进程中起不可或缺的作用。在类似的问题上，Franzen等[8]研究发现,将尿道上皮细胞暴露于肌层浸润性膀胱癌产生的外泌体的环境后，上皮型标志物的表达显著降低，而间质型的表达显著升高，即外泌体在尿路上皮细胞发生上皮-间质型转化过程中起重要作用。Hosseini-Beheshti等[9]探讨外泌体在旁分泌信号通路中的作用时也得出了类似的结论，他们从PCa细胞中提取出外泌体，发现PCa相关的外泌体可以促进癌症的进展，减少细胞凋亡，增加癌细胞增殖，并诱导细胞在LNCaP和rwpe1细胞中迁移，同时还表明，当小鼠静脉内施用DU145细胞来源的外泌体时，可以增加体内肿瘤体积和血清PSA水平。②外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合，非选择性地释放其所含的蛋白质、mRNA以及miRNA。Singh等[15]研究发现，avb3 整联蛋白通过外泌体从致瘤细胞转移到非致瘤性细胞，在靶细胞重新表达的avb3 整联蛋白可以介导靶细胞的迁移和黏附，从而加快局限性PCa向转移性PCa方向发展。相似的研究结果在外泌体相关的avb6 整联蛋白的研究中也得到了印证[19]。同时，Al Saleh等[20]的研究也证实，PCa细胞脱落的EVs可能参与促凝分子组织因子和纤溶酶原激活物抑制剂-1的调节，这与肿瘤细胞的致癌性和转移特性有关。

二、外泌体与PCa

1.外泌体与PCa的诊断：为了解决临床筛查中PSA特异度低的问题，研究者一直在寻找敏感度和特异度均佳的肿瘤标志物，以减少目前临床上无谓的前列腺穿刺活检术。而在这一方面，外泌体显示出很好的临床前景。一方面，外泌体来源广泛，人类细胞分泌的外泌体遍布在血液、尿液以及各种体液(如唾液、腹水、精液等)中，这些检测标本可以采用无创的方法获取，减轻患者痛苦，这是其作为肿瘤标志物的一大优势；另一方面，外泌体独特的双脂膜囊泡结构可以最大程度避免囊内相应的肿瘤相关蛋白、核酸等被外界酶分解。Hendriks等[21]比较了全尿、尿沉渣及外泌体中PCA3和TMPRSS2-ERG的表达，认为外泌体是一种强大的生物标志物来源，但测得的生物标志物水平在全尿中最高，而外泌体次之。针对PCa来说，外泌体的一个独特优势在于，前列腺液中的外泌体也是PCa患者外泌体获取的一个重要标本来源。按摩前列腺后再收集尿液和前列腺液的混合物，所得的前列腺液直接来源于前列腺且富含外泌体，对PCa的早期诊断具有独特价值。Duijvesz等[22]应用高灵敏度时间分辨荧光免疫测定法比较分析了PCa患者和对照组患者尿液中外泌体的表达差异，结果发现PCa患者外泌体膜囊中CD63+和CD9+的表达显著高于对照组，且按摩前列腺后收集到的尿液与前列腺液的混合物其CD63+和CD9+的表达相比普通空白对照组患者显著增高(P=0.000 6)。目前关于外泌体在PCa诊断中的研究不是很多，基于蛋白组学技术，Øverbye等[23]应用质谱法分析了15例健康人和16例PCa患者尿液中外泌体的蛋白质组，以鉴定蛋白质。研究显示，PCa患者尿液中的外泌体，其中246种蛋白质发生了明显的改变。作者发现，17种蛋白质的灵敏度超过60%，特异度为100%。敏感的是跨膜蛋白256(TM256)(94%)、LAMTOR1(81%)和ADIRF(81%)。此外，TM256和LAMTOR1可用于提高检测的灵敏度，报道中TM256的曲线下面积为0.87，与LAMTOR1合并后可增加到0.94。相较于外泌体蛋白质的分析，目前的研究主要还是集中在外泌体的核酸上，如miRNA-1290、miRNA-375、PTEN、TMPRSS2-ERG和PCA3等，其在PCa患者的外泌体中表达均升高[24]。Bhagirath等[25]研究发现外泌体源性的miRNA在侵袭性PCa患者中表达失调。他们分别从侵袭性PCa组(n=6)，年龄和种族匹配的正常病例组(n=3)和良性前列腺增生组(n=3)3组患者血液中提取外泌体miRNA，进行鉴定。结果显示相对于正常组及良性前列腺增生组，miR-1246、miR-766-3p和miR-302c-3p三者在侵袭性PCa中均表达失调。其中外泌体相关的miRNA (ex-miR-1246)可以用于区分正常、良性前列腺增生和侵袭性PCa。与正常组相比，ex-miR-1246在侵袭性PCa中上调>31倍(P=0.026)。与良性前列腺增生相比，ex-miR-1246在侵袭性PCa中上调>23倍(P=0.035)。这表明ex-miR-1246是区分侵袭性PCa和良性前列腺增生的潜在标志物。需要注意的是，外泌体本身作为PCa肿瘤标志物并不具有疾病特异性或者器官特异性，但是外泌体包含的丰富的蛋白质、核酸和脂质等可能具有器官或者疾病特异性，这需要进一步的研究来证实。

2.外泌体与PCa的预后：目前，临床上Gleason评分的高低与PCa生物学行为和预后有较好关联[2]。此外，国际泌尿病学学会和2016年世界卫生组织蓝皮书在原来Gleason评分的基础上提出使用五种危险分层的PCa分级系统，即预后分组(prognostic grade groupings，PGGs)系统。它的5个预后级别(PGGs)按照从1级到5级分别定义为Gleason评分≤6、3+4、4+3、8和>8，且随着级别的增加，观察到基因组发生扩增和缺失(P=0.013)和非同义点突变(P=0.008)的频率显着增加[26]。而从外泌体的作用机制可见外泌体在肿瘤进展、侵袭和转移过程中扮演了重要的角色，因此许多学者猜测外泌体与肿瘤预后相关。目前临床上使用的Gleason评分在这一方面较为准确，但是相对而言，外泌体无疑是个更方便快捷的预测手段，目前对此的研究较少，具体的临床应用价值需要进一步深入研究。研究表明，PCa的微泡(50～150 nm)或前列腺相关的外泌体在PCa患者中的表达水平更高，且与Gleason评分相关，Wang等[10]研究发现，PCa患者血液中的外泌体循环长链非编码RNA正在成为对肿瘤诊断有价值和非侵入性生物标志物，其中SAP30L-AS1的表达水平与PSA值和肿瘤侵袭有关，另外 Gleason评分较高的患者SChLAP1表达也显着升高。Li等[14]研究认为，在PCa患者中，血清外泌体miR-141的水平明显高于前列腺增生患者和健康对照组，且其中转移性PCa患者水平最高。与前列腺增生患者或是健康志愿者相比，PCa患者血清外泌体中的miR-141上调，其中在转移性PCa患者中，miRNA-141达到最高水平，而受试者操作特征曲线显示，血清外泌体的 miR-141在局限性PCa患者中鉴别出转移性PCa患者的灵敏度为80%，特异度为87.1%，曲线下面积为0.869 4，这提示其可能是诊断转移性PCa的一种有用的潜在生物标志物。Stone[5]联合外泌体基因表达测定以及SOC测试(包括PSA水平、年龄、种族和家族史)，发现它们在预测Gleason评分≥7和阴性活检结果方面比单独SOC测试更好，且针对高级别PCa，当临界值为15.6时，灵敏度为92%，活检抽样回避率为27%，而只有大约8%的Gleason评分≥7的癌症会被遗漏。类似的研究中，Bhagirath等[25]发现PCa阳性淋巴结转移与血源性外泌体提取到的标志物ex-miR-1246的高表达之间存在相关性(P=0.043 6)，这也进一步说明该miRNA具有预测PCa侵袭性或者局部转移的潜力。此外高表达的ex-miR-1246与病理分期之间存在显着的负相关(P=0.002 0)，表明该外泌体标志物会随着PCa分期的增加而增加。另外一项关于PCa合并骨转移的研究发现，PCa细胞外泌体中高表达的hsa-miR-940在体外可以促进人间充质干细胞的成骨分化，并在体内骨转移微环境中诱导广泛的成骨细胞损伤，这说明外泌体在PCa骨转移方面具有预测价值[17]。

三、总结与展望

外泌体的组成复杂多样，广泛分布于人体全身各个组织、器官，在生命活动的发生、发展中起重要的作用，特别是在癌症发生、发展的过程中发挥的作用已经得到多方面的验证。这些特点说明外泌体作为一个天然的优秀的肿瘤标志物潜力巨大，而对于外泌体与PCa的研究目前还处于起步阶段。需要注意的是，外泌体不具有疾病特异性，也不具备器官特异性，目前外泌体作为PCa的肿瘤标志物的研究中，需要解决的问题主要有3个：①迫切需要找到一种提纯、分离以及鉴定外泌体的方法，尽量提高外泌体提纯精度的同时减少繁杂的步骤，从而便于外泌体研究的推广。②外泌体的来源广泛，在血清、全血、尿液和精液等中均可检出，不同体液的外泌体其成分、含量均有明显差异，对于PCa外泌体的研究，在留取检验标本以及留取后标本的保存等问题上目前还没有统一的意见。③目前有关外泌体对PCa的预后和诊断价值的研究较少，需要更多的临床研究加以佐证。对于外泌体在该过程中发挥作用的方式亦需要进一步探讨，这同时也对目前生化技术的发展提出了挑战。