男性不育患者Y染色体AZF基因微缺失检测和染色体核型分析*

张丽洁，赵 园，赵乔佳杰，王九菊，李艳春，魏绪仓

(陕西省人民医院血液遗传研究所，西安 710068)

目前越来越多的育龄夫妇患有不孕不育症，其中男性方面因素约占 30%～50%，由遗传因素导致精子生成障碍约占男性不育症的30%[1]。克氏综合征(klinefelter syndrome，核型为47，XXY)和Y染色体微缺失是引起男性不育的前两位遗传因素。克氏综合征在人群中的发生率约为1/1 000，不育男性中占1/10，是发生率较高的一种性染色体病。研究证明，Y染色体上长臂1区1带(Yq11)存在精子生成相关基因，即无精子症因子(AZF)，分为AZFa，AZFb和AZFc 3个区域，这些区域的缺失会导致生精障碍，引起少精子症或无精子症[2]。

本研究对60例不育患者进行Y染色体微缺失检测和染色体核型分析，进而在细胞和分子遗传水平探讨男性不育的原因。

1材料与方法

1.1 研究对象 收集2018年1月～2019年1月陕西省人民医院男科门诊就诊的60例男性不育患者(严重少、弱精症和无精症)的全血标本，对照组为30例精液常规检测正常的男性志愿者，年龄20～42岁。

1.2 仪器与试剂 德国ZEISS显微镜及染色体图像分析系统。Roche Cobas z480荧光定量PCR仪，外周血淋巴细胞培养基(广州市达晖生物技术有限公司)，Chromed G吉姆萨染液(上海乐辰生物科技有限公司)，外周血DNA提取试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司)，Y染色体微缺失检测试剂盒(上海透景生命科技股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 Y染色体微缺失检测

1.3.1.1 PCR反应体系：实验操作按照上海透景科技公司的Y染色体微缺失检测试剂盒进行，采用多重荧光定量PCR方法判断AZFa区(sY84，sY86)，AZFb区(sY127，sY134)和AZFc区(sY254，sY255)的6个序列标签位点(STS)的微缺失，同时设置男性性别决定基因(SRY)和编码锌指蛋白基因(ZFX/ZFY)为两个内对照基因。SRY，sY84，sY127和sY255为组别A，ZFX/ZFY，sY86，sY134和sY254为组别B。4种荧光标记FAM，VIC，ROX和Cy5分别对应内对照(SRY，ZFX/ZFY)，AZFa(sY84，sY86)，AZFb(sY127，sY134)和AZFc(sY254，sY255)。

1.3.1.2 PCR扩增反应条件：第一阶段： 50℃ 2 min，95℃ 5 min；第二阶段95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，38个循环，在每个循环的60℃时收集FAM/VIC，ROX和Cy5信号；第三阶段72℃延伸5 min。

1.3.1.3 结果判读：通过分析扩增曲线判读结果，出现典型的S型扩增曲线且Ct值小于32表示基因表达正常，否则表示缺失。

1.3.2 染色体核型分析

1.3.2.1 染色体核型标本制备：采用常规细胞遗传学方法进行外周血淋巴细胞培养和G显带染色体核型标本制备。

1.3.2.2 核型分析：采用Ikaros核型分析系统软件计数20个中期分裂相，采集5个中期分裂相以分析核型。

2结果

2.1 不育患者Y染色体AZF基因微缺失结果分析 60例男性不育患者中Y染色体AZF基因缺失的有2例，检出率为3.33%，且均为AZFc区的sY254，sY255位点缺失。30例精液常规检测正常的志愿者未检测到AZF基因缺失。

2.2 60例不育患者的染色体核型分析结果 在60例严重少精症和无精症的不育患者中检出5例异常核型(占8.33%)，均为克氏综合征(47，XXY)，其中3例患者还出现乳房发育和激素水平的异常，即卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、泌乳素(PRL)的水平异常增高和睾酮(TT)水平下降等。该5例染色体异常患者的Y染色体AZF基因并无缺失。

3讨论很多原因会导致男性不育，遗传性因素致生精障碍引起的不育占30%，临床上主要表现为严重少、弱精症和无精症。目前临床对男性不育的鉴别大多基于常规精液分析和血清生殖激素的测定，但这些检测并不能明确患者是否具有生育能力及对后代的影响，因而开展细胞和分子遗传检测对患者的诊断和治疗具有重要意义[3-4]。

克氏综合征和Y染色体微缺失是导致精子发生障碍的主要遗传性缺陷。克氏综合征患者临床多表现为身材高大、睾丸小、第二性征发育不良、不育等，典型病例的血浆睾酮仅为正常人的一半，个别患者睾酮正常。外周血染色体核型分析是诊断克氏综合征的主要实验依据。本文对60例不育男性患者的染色体核型分析结果与陈琨等[5]对574例男性不育患者的核型研究结果一致，即不育男性中约有8%为克氏综合征患者。

Y染色体微缺失发生的区域不同，不育患者的临床表型也有所不同，因此明确Y染色体微缺失有无及缺失位点类型有助于临床医师为不育患者选择最佳的治疗方案。AZFa缺失发生频率最低，一般表现为无精症和唯支持细胞综合征(SCOS)，此类患者不建议做单精子胞浆内注射手术(ICSI)；AZFb，AZFb+c缺失可导致SCOS或生精阻滞，也不建议做ICSI；AZFc缺失最为常见，表现为严重少精症或无精症，该类患者尚存精子生成能力，可通过ICSI等辅助生育手段获得后代，建议生女孩，避免AZFc缺失在男性后代的传递[6-7]。目前国内不同地区研究者报道的AZF基因微缺失发生率有所不同。曹金如等[8]对东莞地区的120例不育患者的Y染色体AZF基因微缺失的检测中发现23例AZFc区缺失，检出率为19.2%，未发现其它区域缺失。樊冰等[9]通过对深圳地区180例男性不育患者的Y染色体微缺失的分析发现18例AZFc缺失，2例AZFb+c缺失，缺失检出率为11.11%。韩瑞玲等[10]发现346例男性不育患者中有17例Y染色体微缺失，缺失检出率为4.9%。本研究中的Y染色体微缺失检出率偏低，这可能与地域差别，或选择的STS位点有关，且此次分析的标本量偏少，有待后续研究中增加标本量进一步探讨Y染色体微缺失与男性不育的相关性。

综上所述，遗传缺陷导致的精子生成障碍是男性不育的重要因素。染色体核型分析和Y染色体AZF基因微缺失检测有助于筛查男性不育的原因，为医师对不育男性的合理诊疗提供依据。