中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因单核苷酸多态与性早熟的关联性分析

殷悦，徐宇，唐刘秀，陆全平，许志强

（江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017）

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹，是我国最重要的淡水养殖品种之一。性早熟是当前影响河蟹养殖效益的瓶颈问题之一，性早熟幼蟹在培育过程中性腺当年发育成熟，不能继续顺利蜕壳，体质量增长缓慢甚至停滞，绝大多数在第2年4—5月期间死亡，不能再继续饲养至2龄成蟹规格[1]。此外，由于性早熟一龄蟹的大量存在，在蟹种培育阶段还导致了饲料的巨大浪费，严重影响了河蟹养殖效益。河蟹养殖过程中发现，即使在相同的外在环境条件下，也只有部分个体发生性早熟。这一现象表明，除了外部环境因素外，个体内在的遗传因素同样会影响河蟹性早熟的发生[2-4]。甲壳动物眼柄内的X-器官-窦腺复合体是其神经内分泌的主要调控中心，与蜕皮、生殖以及血糖代谢等生理功能密切相关[5]。目前，在河蟹以外的多种甲壳动物的X-器官-窦腺复合体中已分离和鉴定出了高血糖激素家族激素（主要有GIH、MIH、CHH和MOIH等）以及促色素细胞激素家族激素（主要有RPCH和PDH等）等多种神经肽类激素，这些激素均以颗粒的形式在窦腺中储存和释放，调控着甲壳动物的蜕皮、生殖、血糖代谢及其对环境的适应等生理功能。蜕皮抑制激素基因（MIH）是由眼柄的神经内分泌细胞分泌的一种多肽神经激素，MIH不仅在协调蜕壳方面发挥了内分泌调节器的作用，而且在卵黄生成过程中也发挥着重要的生物学功能[6-10]。

该研究以河蟹蜕皮抑制激素基因（MIH）编码区序列上的SNPs为研究目标，采用PCR产物直接测序和PCR-RFLP技术相结合的方法对蟹种群体（正常群体及性早熟群体）进行基因分型，发现位于MIH基因内含子区一个SNP位点（SNPg.2466 C＞T）与中华绒螯蟹的性早熟之间存在较具统计学意义的相关性（OR=0.459，95%CI 0.223～0.944，P=0.034），该研究可为后续选育低性早熟河蟹新品种提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

蟹种培育在江苏省淡水水产研究所江浦基地进行，每667 m2放养1.5 kg大眼幼体，采用江苏地区常规养殖方式进行蟹种培育。翌年3月从同一养殖池塘内随机采集性早熟蟹和正常扣蟹样本各100只以上（雌雄各半），样品活体运输至实验室后取附肢肌肉于-20℃冷冻保存备用。

1.2 基因分型

1.2.1 SNPs所在序列的PCR扩增 随机挑选30只蟹种并提取每个样本的基因组DNA，根据中华绒螯蟹MIH基因序列信息（AY310313）设计引物扩增外显子区和内含子区（3个外显子及2个内含子），采用PCR产物直接测序筛选区段的SNP位点（引物未列出）。根据得到的SNPs信息，分别设计引物扩增包含不同SNP位点的序列片段（表1）。PCR反应体系为 25 μL（Vazyme Biotech Co.,Ltd），其中包括 2×Taq Master Mix 12.5 μL，dNTP（2.5 mM）1 μL，正反向引物（10μM）各1μL，ddH2O补足体积至25μL。PCR反应共计30个循环，循环前94℃预变性5 min，每个循环包括94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循环结束后于72℃延伸5 min。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后于-20℃保存，用于后续酶切反应。

1.2.2 基因分型 内含子区2的SNPs分布较为集中，采用PCR产物直接测序法对该区域内的6个SNPs进行基因分型，采用PCR-RFLP对剩余SNPs进行基因分型。PCR产物酶切过夜后用3%琼脂糖凝胶电泳进行分离以确定每个样本的基因型，随机挑选个体采用PCR产物直接测序法对基因分型结果作进一步验证。

表1 中华绒螯蟹MIH基因编码区SNPs基因分型所用引物及限制性内切酶

1.3 统计分析

对性早熟和正常发育蟹种群体进行单个位点的性状-基因型关联分析（基于共显性模型和相加模型的Logistic回归分析），并计算相对应的相应P值及比值比（Odds Ratio,OR）及其95%可信区间（confidence interval,CI），筛查与中华绒螯蟹性早熟性状具有统计学意义相关性的SNP位点。

2 结果与分析

对随机选择的30个正常蟹种的MIH基因（外显子区及内含子区）进行SNPs筛查，共鉴定出10个SNPs（表1）。其中，外显子区共检测到3个SNPs（SNP g.422 C＞T，SNP g.1714 A＞C，SNP g.2529 C＞T），内含子区共检测到7个SNPs（SNP g.2384 C＞A，SNP g.2387 A＞G，SNP g.2410 C＞A，SNP g.2415 T＞C，SNP g.2416 T＞C，SNP g.2430 T＞C，SNP g.2466 C＞T）。

对10个SNP位点在所有样本中的基因型分布情况进行基因分型，各个SNP位点不同基因型个体的数量以及不同基因型个体间的差异统计学意义分析结果见表2。性状-基因型关联分析结果显示：位于MIH基因内含子2的一个SNP位点（SNP g.2466 C＞T）与河蟹性早熟之间存在着具统计学意义的相关性（OR=0.459,95%CI 0.223～0.944,P=0.034）。SNP g.2466 C＞T的PCR-RFLP基因分型图谱以及PCR产物直接测序验证图谱见图1。

3 讨论

MIH作为甲壳动物高血糖激素（CHH）家族的一员，是一种由XO-SG中的神经内分泌细胞分泌的多肽神经激素，它对甲壳动物的生长发育起着至关重要的作用。由于不正常的蜕皮现象在性早熟河蟹中广泛存在，因此可以推测MIH基因变异可能与中华绒螯蟹的性早熟有关。之前的有关研究发现，在多数甲壳动物中，MIH基因的变异被认为是影响生长和繁殖性能的主要内在因素[11-12]。目前，已有研究者从一些甲壳动物如中华绒螯蟹（Eriocheir sinenis）、斑节对虾（Penaeus monodon）和南美白对虾（Litopenaeus vannamei）的MIH基因中鉴定筛选出SNPs位点[13-14]。该试验室在中华绒螯蟹MIH基因中发现了一个与性早熟具统计学意义相关的SNP。Li等[15]在南美白对虾MIH基因中发现了一个与生长性状具统计学意义相关的SNPs A＞G 171。

表2 中华绒螯蟹MIH基因编码区10个SNPs的基本信息及其在性早熟与正常河蟹群体中的分布情况

表3 SNPg.2466 C＞T与中华绒螯蟹性早熟的关联性分析

图1 SNPg.2466 C＞T PCR-RFLP基因分型及测序验证注：（A）SNP C2466C 基因型模式（3%琼脂糖凝胶电泳）：CT（泳道 2），CT（泳道 3），CC（泳道 4）和 TT（泳道 5）。（B）MIH SNP C2466C基因型的测序验证结果。

近年来，已有许多国内外学者开始关注SNP变异与水产动物重要经济性状之间的相关性研究。Li X等从加州鲈（Micropterus salmoides）的IGF-Ⅱ基因中共鉴定出4个SNPs，发现特定的SNP单倍型（CTCC/CGCC和CTCC/TTTT））与加州鲈生长性状之间存在着具统计学意义的相关性（P＜0.05）[16]。Wang GL.等从三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）的 SOD3基因中鉴定出了18个SNPs，发现有2个SNP变异（g.7994C＞G和g.8087G＞C）与三角帆蚌对嗜水气单胞菌的抗性性状之间存在具统计学意义的相关性 （P＜0.05）[17]。Fu GH 等从亚洲鲈鱼（Asian seabass）的LECT2基因上发现了3个SNPs，但是未发现这些SNPs与Big belly disease疾病抗性之间存在具统计学意义的相关性[18]。目前，与其他水产物种相比，国内外关于河蟹遗传变异与某些重要生物学性状之间的相关性研究较少。该研究发现位于MIH基因内含子区一个SNP位点（SNPg.2466 C＞T）与中华绒螯蟹的性早熟之间存在具统计学意义的相关性（OR=0.459,95%CI 0.223～0.944,P=0.034）。在以低性早熟为选育指标的河蟹遗传育种研究过程中，通过对河蟹育种群体进行SNP g.2466 C＞T基因分型，结合形态学特征分析，可以优先选择基因型为TT的个体作为育种亲本，该研究对于后续选育大规格河蟹新品种具有重要的指导意义。