植物根系成像技术研究进展及马铃薯根系研究应用前景

秦天元 孙 超 毕真真 王 瀚李 鑫 曾文婕 白江平,∗

(1甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室/甘肃省干旱生境作物学重点实验室,甘肃兰州 730070;2 甘肃农业大学农学院/甘肃省作物抗逆种质创新与利用工程研究中心,甘肃兰州 730070)

根是植物地下部分为适应陆地生活长期进化而形成的营养器官,具有支撑地上部分的基本作用[1],还是植物从土壤中吸收生长发育所需水分、各种无机盐离子及其他必需养分的器官[2-4]。 因此,研究作物不同生育期根系的生长特点、水分和营养元素的吸收与利用及其在土壤中的分布情况,对提高作物产量、增强作物的抗逆性具有重要意义。 研究植物根系的传统方法有挖掘法、钉板法、容器法、玻璃管法及改良后的根室等[5-6],但这些方法会对植物根系造成不同程度的损伤,且存在一定的局限性。 随着科学技术的发展,成像技术的出现为植物根系的研究提供了新的解决方案,但目前成像技术在植物根系研究中的应用尚处于发展阶段,多用于水稻[4]、小麦、玉米及少数树木的研究[6]中,而在马铃薯、甜菜等块茎、块根类作物研究中的应用尚鲜见报道。 因此,本文通过对近年来根系成像前沿技术特点及应用范围进行归纳、总结与分析,以期为今后植物根系成像技术在马铃薯根系研究中的应用提供技术参考。

1 植物根系研究的发展简史

植物根系的研究最早始于18 世纪,1727年Hales直接挖掘栽培作物的根系,人工测量了根的长度和重量并记录了根系形态特征[5]。 直到19 世纪中期,施用无机化学肥料使农作物的产量成倍增加,研究植物根系再次进入到科学家的视野中,陆续出现了玻璃管法、容器法等多种研究根系的方法,达到了植物根系研究的高峰时期。 20 世纪初Cannon 在研究沙漠植物直根与侧根的变异性时提出了“根构型”概念;1995年Lynch 对“根构型”进行定义,并给出明确的概念[1]。20 世纪中期后,随着精密光学仪器的开发和计算机技术的应用,植物根系研究进入了一个新的发展阶段。

根系成像技术始于1873年,Bohn[5]采用玻璃板法用肉眼观察并人工手绘植物根系,但该成像方法只是按照比例大致绘画植物根系在土壤中的分布情况,无法准确描述根系在土壤中的生长发育情况。 1937年,Bates[7]提出玻璃管法观测植物根系生长情况,但该方法因受试验材料和条件的限制,直到1974年才应用于田间自然条件下观测作物根系。 之后,在玻璃管法的基础上进行改进、完善形成了“微根窗”[8]成像技术。 1995年Dubach 等[9]利用微根窗技术观测紫花苜蓿的根系。 20 世纪中期,同位素示踪法[10]被应用到植物根系研究中,即利用同位素放射自显影技术观察植物根系在土壤中的分布情况,使植物根系成像技术进入了一个新的阶段。 20 世纪中后期,植物根系成像技术研究进入蓬勃发展时期。 20 世纪80年代,中子成像技术应用于植物根系研究[11-12]。

随着科技的快速发展,光学电子仪器和数字成像技术被用于植物根系研究中。 Costa 等[13]采用扫描原理观测、分析玉米根系动态特征。 吴长高等[14]将计算机视觉技术用于植物根系形态和结构的分析研究。 20世纪末期,科学家们利用现代科学技术获得植物三维图像、无损检测技术研究植物在田间自然条件下的生长情况,开展了对植物根系的原位观察研究。 近年来,用于根系动态监测的系统不断问世,如CI-600 根系生长监测系统(美国CID 公司)、Win/Mac RHIZO 根系图像分析系统(北京澳作生态仪器有限公司)、ET-100根系生态监测系统(美国Bartz 公司)等。 植物根系成像技术的发展对研究植物根系具有重要作用,不仅为研究植物根系生长发育情况提供了新的方法,还在一定程度上解决了因土壤的不透明性而造成的根系直接成像难的问题。 植物根系成像技术分为传统成像技术和现代成像技术。 传统的植物根系成像技术是指用肉眼直接观察、手绘植物根系和借助简单的光学仪器对植物根系照相。 现代植物根系成像技术是利用现代的仪器设备对植物根系进行照相,如中子成像技术、螺旋CT 三维成像技术、荧光成像技术、多光谱成像技术等。

2 不同植物根系成像技术的应用与特点

2.1 玻璃板或玻璃管法

2.1.1 玻璃板法 玻璃板法是指在土壤垂直剖面安装一块玻璃板,透过玻璃板来观察植物在土壤中的生长情况。 玻璃管法能在土壤中直接观察到植物根系,但由于玻璃板安装位置固定,无法大范围观察植物根系的分布情况和最大深度,因此多用于砂质土壤研究植物根系,在粘土特别是含水量较高的粘质土不宜采用该方法,这是因为粘质土颗粒过小、水分过多会影响观察的清晰度,产生较大误差[5]。 1873年,Sachs 首次采用玻璃板法记录、观测植物根系生长情况[24]。 1916年,McDougall 在自然条件下采用玻璃板法研究植物根系,主要记录根系的颜色、大小和形状[25]。

2.1.2 玻璃管法 玻璃管法是指在土壤中安装一根玻璃管,紧贴玻璃管种植植物,通过玻璃管观察植物根系在土壤中的生长情况(图1)。 Bates 在1937年首次提出用玻璃管观测植物根系[7],并于1974年在田间条件下观察植物根系[5]。 通过调节发光源的亮度可以观测土壤不同深度的根系,最大深度可达到1 m。 该方法能有效观察单株植物根系的生长情况,但是观察多株植物的根系就要安装更多的玻璃管,在玻璃管上画上方格,以计算单位面积内植物根系的数量。 此方法的不足之处在于玻璃管在土壤中时间过长时其位置会发生改变,此外,土壤中的杂质吸附在玻璃管壁上也会影响观察的清晰度。

2.2 放射性成像技术

图1 玻璃管成像系统组成Fig.1 Image acquisitionsystem of the glass tube

2.2.1 中子成像技术 中子成像技术[11]是热反应堆产生的中子通过栽培植物的容器,在另一端的探测器转换屏上得到栽培植物的根系图像。 植物根系和土壤含水量不同,热反应堆产生的中子透过栽培植物的容器,会发生不同程度的衰变,从而得到该栽培植物的根系图像。 Hawkesworth[12]于1976年利用中子照相技术研究了植物根系;我国科学家苗齐田等[11]于1984年利用中子照相技术研究玉米根系,得到了玉米幼根的生长图像,并测量了根长。 该方法在实际操作中存在较大局限性,对实验设备要求较高,需要专业人员进行测定,且热反应堆产生的辐射长时间照射会影响植物的正常生长发育,因此无法连续观察植物根系的生长发育情况。 此外,植物根系、土壤水分的变化也会影响根系成像质量。

2.2.2 放射性示踪法 利用放射性示踪法测定根系活性的方法有2 种:一,在植株周围的土壤表面和不同深度放入示踪物,植物吸收后从土壤剖面测定示踪物含量研究根系活性;二,在植物茎上注入示踪物,采集植物根-土壤样品,测量示踪物含量研究植物根系活性。 示踪物都是同位素,利用示踪物的自显影技术成像并用成像软件(VG StudioMAXw 2.1)处理图像。 与中子成像技术相比,该方法中示踪物不影响植物的正常生长发育,且注入的示踪物是植物生长发育的必需元素,但由于土壤是由各种矿物质、有机质、水分等成分组成,非常复杂,本身可能就含有多种放射性物质,因此会使成像结果产生误差。

2.3 现代数字成像系统

2.3.1 微根窗法 1937年,Bates[7]首次提出微根窗的概念,之后逐渐发展成为研究植物根系常用的工具。典型的微根窗成像系统是由插入土壤中的摄像系统、地上控制器和1 台计算机组成(图2)。 该方法能对同一细根的出现、生长、衰老、死亡和消失进行连续观察,在研究细根周转率、生命周期和分解速率等方面优势显著。 但玻璃管安装会使周围环境发生变化,影响植物的生长发育。 在植物根系生长过程中可能会产生大量的细根围绕在玻璃管周围,影响观测的准确性。

图2 微根窗图象采集系统组成[26-27]Fig.2 Image acquisition system of minirhizotron[26-27]

2.3.2 洗根扫描法 洗根扫描法是基于挖掘法、土钻法、内生长土芯法或容器法获取根系,通过Epson 扫描仪(日本精工爱普生公司)等图像获取系统获取根系平面几何构型图像,利用WinRHIZO Pro(北京澳作生态仪器有限公司)等图像分析处理软件,进行根系构型分析。 该方法可用于根系形态、拓扑结构、根系颜色等研究,但无法进行动态监测。

2.3.3 X 扫描成像技术 X 扫描成像技术主要是利用X 射线[19]对植物根系直接扫描。 平板探测器就是利用X 射线穿过植物样品会发生衰减,在探测器上根据射线衰减程度重建根系图像(图3)[28]。 平板探测器用来接收穿过植物的射线信号并与计算机连接,进行植物图像采集与重建。 机械扫描系统通过控制植物与扫描设备的距离对植物根系进行扫描。 该成像技术可以在不损坏植物根系的情况下在植物不同生长时期直接对植物根系进行成像,适用于盆栽植物的根系研究。 Moran 等[20]利用X 射线扫面成像技术研究了植物根系在土壤中的分布情况;Gregory 等[29]采用X 射线微层析成像系统研究麦苗和油菜的根系,并对生长8～10 d 的麦苗根系进行三维图像重建。 该方法以RootViz FS(植物根系X-光扫描成像分析系统)[30]为代表,是一种高效率、高精度、非破坏性的根系原位分析方法,可以全方位分析植物根系所有部分(包括根尖等),还可在植物生长的不同阶段对根系的生长进行长期动态监测。

2.3.4 探地雷达 探地雷达[31-32]通过利用高频电磁波在不同介质中传播会发生反射来获得介质中物体的图像。 用高频电磁波扫描土壤,利用接收器接受反射回来的电磁波,通过分析获得土壤中的植物根系。Ellis 等[33]采用该技术研究幼龄树木,完成了幼龄树木根系图像重建;Butnor 等[34]采用该方法研究了人工火炬松(Pinus taeda L.)的根系。 探地雷达技术具有一定的局限性,只能对较大根系进行成像,无法探测到细小的植物根系,因此不能用于栽培作物的根系研究。 此外,受土壤电磁波特性、仪器设备价格高等因素的影响,也使该方法的应用受到较大限制。

图3 平板探测器根系成像系统[28]Fig.3 Image acquisition system of Flat Panel Detector[28]

图4 共聚焦显微镜简化原理图Fig.4 Confocal microscopes simplify schematics

2.3.5 核磁共振成像技术 核磁共振成像[35-36]是以射频电磁波为信息载体,通过检测磁场中物体不同位置核磁共振信号获得编码核磁共振信息生成图像,进而利用计算机重建物体内部影像的一种现代层析成像技术。 核磁共振成像与被检测物水分含量有关,是一个多参数成像系统,可以提供多种对比图像。 张建锋等[18]采用核磁共振成像技术研究了大豆、玉米和茄子3 种作物的根系,并采用最大密度投影(maximum intensity projection, MIP)、 容 积 再 现 技 术(volume rendering, VR ) 和 多 平 面 重 构 ( multiplanarreconstruction, MPR)3 种方法对植物根系进行重建。 核磁共振技术主要用于植物主根和主要侧根的研究。 当植物侧根直径在2 mm 或者接近2 mm 时其三维重建图像是断点组成的虚线,远小于2 mm 的侧根则无法呈现,此外,植物类型、土壤水分等也是影响核磁共振成像质量的重要因素。

2.3.6 荧光成像技术 目前,光化学传感器的发展已成功应用于多个领域,荧光物质聚合在一起形成一个传感箱,荧光物对pH 值和氧气浓度的变化非常敏感[37-38]。 Hendrick 等[39]将荧光成像技术与中子照相技术结合,检测了土壤水分变化对森林生物群落根系的影响。 Rudolph-Mohr 等[40]采用该方法检测了白羽扇豆(Lupinus albus)根系在土壤中的生长与分布。 荧光成像技术是借助荧光传感器对植物根系进行成像,因此荧光强度、光照时间和土壤水分变化对其成像质量影响均较大。

2.3.7 激光共聚焦显微成像技术 激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)是激光、高分辨率显微成像技术和计算机图像处理等现代高科技手段与传统的光学显微镜结合产生的先进的生物学分析仪器(图4)。 普通的荧光光学显微镜在面对较厚的标本进行观察时,来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。 而共聚焦显微技术的关键在于,每次只对空间上的一个点(焦点)进行成像,再通过计算机控制的每个点的扫描形成标本的二维或者三维图象。 此过程中来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰,从而提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力[41-42]。 由于精度较高,对根研究而言,目前在拟南芥根尖等细小组织的显微结构观测中应用较为成功,但对超过一定体积和厚度的样本无法观察。

2.3.8 多光谱成像技术 多光谱成像仪是一种获取光谱特征和图像信息的基本设备,是把入射的全波段或宽波段的光信号分成若干个窄波段的光束,然后把它们分别成像在相应的探测器上,从而获得不同光谱波段的图像。 植物根系对各个波段波长光的反射、透射和激发荧光情况分别进行光谱信息和图像的采集,再将在各个波长下的图像信息合成一个全波段的集合,该集合上记录了根系每个单位的光谱数据信息。将这些原始的图像信息经信息处理中心作进一步加工处理后,可获得清晰直观便于判读的根系图片。

2.3.9 高光谱成像技术 高光谱成像技术是源于非常多窄波段的影像数据技术,它将光谱技术与成像技术相结合,探测目标的三维几何空间和一维光谱信息,以获取连续、窄波段高分辨率的图像数据(图5)。 高光谱遥感信息分析处理,集中于在光谱维上进行图像信息的展开和定量分析,其图像处理模式的关键技术包括:超多维光谱图像信息的显示,如图像立方体的生成;光谱重建,即成像光谱数据的定标、定量化和大气纠正模型与算法,依此实现成像光谱信息的图像-光谱转换;光谱编码,尤其指光谱吸收位置、深度、对称性等光谱特征参数的算法;基于光谱数据库的地物光谱匹配识别算法;混合光谱分解模型;基于光谱模型的地表生物物理化学过程与参数的识别和反演算法[43-44]。

图5 高光谱成像系统Fig.5 Hyperspectral imaging system

高光谱成像仪具有图谱合一的优势,利用波长扫描式获取植物根系结构图像,可以精确到某一个点去探测研究目标在不同胁迫下的特征,又可获取受胁迫目标表面的光谱信息,点面结合综合地反映目标遭受胁迫的程度。 因此,高光谱成像技术已经成为国内外研究的热点。 学者们利用高光谱成像技术可以量化地提取研究目标所遭受的各种胁迫特征,根据高分辨率的图像对目标整体或局部区域进行分析,从而可以在更加微观的尺度上进行机理探测研究[45-47]。

2.3.10 计算机断层扫描成像技术 计算机断层扫描成像(computed tomography,CT)技术是一种依据外部投影数据重建物体内部结构图像的无损检测技术。 植物根系原位CT 序列图像处理中,合适的图像分割技术是直接影响植物根系三维重建精度和定量分析结果准确性的关键技术,在植物根系原位形态无损检测技术研究中具有举足轻重的地位和作用[48]。 原位根系CT 图像分割是借助分割算法,通过计算机将植物根系(剖面)从含有土壤等介质的CT 断层图像中分离、提取出来,用于后续的三维重建和定量分析[49]。 该方法能够解析出不受土壤介质干扰的根系三维立体构型,且不同时期连续测量可动态观察根系结构的生长变化。

2.3.11 其他成像技术 纸质成像系统是最近出现的研究植物根系的一种技术。 该方法将植物培养在2 个平板中间,覆盖发芽纸来提供水分和养分,Marié 等[50]采用该方法观测到玉米根系结构,对玉米根系的发育状况进行了研究。 但纸质成像系统需要特定的仪器设备、植物生长环境不易控制、培养的植物相互之间易发生病菌的感染。 非插入性成像技术是利用3D 成像技术和数字表现的形式从根的网状分布、大小解释根的形态结构。 Topp 等[51]采用该方法观测水稻根系,发现了控制根系数量性状位点的中心基因组区域。 电阻抗成像技术是近30年来发展形成的新型成像系统,李星恕等[52]采用该方法进行了土壤-树根系统图像重建,完成了树木单根断层的图像重建。 但该方法对检测物体表面施加电流,因此不能长时间观测植物根系,不适于研究植物根系生长发育情况。

2.3.12 根系系统分析软件 随着电子计算机的发展,计算机软件逐渐应用于根系研究,根系分析系统的出现为植物根系研究提供了极大的便利。 目前主要使用的根系分析软件为WinRHIZO Pro(北京澳作生态仪器有限公司)、GIA Root(美国佐治亚理工学院和杜克大学的团队合作研发)[21]、SmartRoot(加拿大SMART技术公司)、EZ-RHIZO 1.0(美国赛普拉斯公司)及Root flow RT(美国Phenotype Screening 公司)[22]。Armengaud 等[22]采用EZ-RHIZO 研究了土壤中植物根系结构;Van der Weele 等[23]利用Root flow RT 研究了拟南芥、番茄等植物根系生长速率。 这些分析软件主要由成像系统和运动控制系统组成。 成像系统利用照相机和摄像仪对试管苗进行直接照相,然后在计算机上通过图像分析软件对图像进行处理。 运动控制系统是通过计算机来自动控制试管苗的转动速度,将试管苗放在机械旋转装置上,用摄像机采集试管苗的图像,通过图像处理系统将分析采集到的二维图进行三维根系图像的重建,以此得到根系的相关特征。 但该方法只能用于植物幼苗根系的研究,植物需在透明容器中生长且在较长时间内能够连续照相。 此外,该方法对培养基要求严格,培养基需要达到一定的透明度,否则会影响根系成像质量。 因此,该方法只能在实验室内进行,无法模拟根系在自然条件下的生长状态,具有一定的局限性。

3 成像技术应用于马铃薯根系研究的展望

目前,马铃薯(Solanum tuberosum L.)是仅次于小麦、水稻和玉米之后的世界第四大粮食作物[53],因其优良的加工品质、较强的适应性、高营养价值和低生产成本而广受人们关注。 马铃薯是块茎作物,主要收获的是地下部分,其块茎和根系生长环境一致。 因此,根系成像技术在马铃薯等块茎、块根类作物中的应用尤为重要。

马铃薯根系成像技术是研究马铃薯根系性状的新方法,尚处于发展阶段,具有较大的发展潜力。 主要围绕以下几个方面开展研究工作:第一,利用根系成像技术研究马铃薯根构型,通过改变马铃薯的根构型以提高水分利用率,增加其抗旱能力;第二,利用根系成像技术研究地下部分对地上部分的影响,提高地上部分对光能的利用率,进而提高光合作用,快速积累更多的同化物增加单位面积产量;第三,利用根系成像技术研究根系对营养元素的吸收情况,为植株生产种植过程中合理施肥,合理密植提供指导;第四,利用根系成像技术监测块茎的分布和发育状况。在马铃薯不同生育时期,采用不同的成像技术研究马铃薯根系及块茎生长发育的特点。 研究马铃薯幼苗根系特点时,将马铃薯的组织培养在透明容器中,利用计算机断层扫描技术获得不同方位根系照片,然后利用GIA Root、SmartRoot 等根系图像软件分析得到的图像研究马铃薯幼苗根系。 以块茎繁殖的马铃薯没有明显的主根为须根系,采用X 射线扫描技术研究根系的变化特征,可根据根系对X 射线折射率不同得到根系的分布情况。 马铃薯根系的研究不宜采用核磁共振成像技术,因为核磁共振成像技术对较小的根系不能成像或成像质量不高,产生误差较大。 中子成像技术需要特定的热反应堆、中子发射仪,且对植物生长影响大,所以也不适于马铃薯根系研究。 放射性示踪法和荧光成像技术主要是利用放射自显影技术对根系成像,但无法区分是马铃薯块茎还是根系反应的信号,因此也不适于马铃薯根系的研究,其他的根系成像方法在马铃薯根系研究中的应用尚处于摸索阶段,后期随着科技的发展,一些新的研究分析方法会不断地应用到马铃薯根系的研究中,帮助人们了解到更多有关根系生长发育的问题。