PAS 蛋白融合修饰研究进展

韩斐 江明锋 冉嫆 王刚

（1. 西南民族大学青藏高原研究院，成都 610041；2. 四川大学国家生物医学材料工程研究中心，成都 610064）

随着分子生物学的发展，由于多肽药物具有作用专一、高效等优点，目前多肽类药物的研制和应用已成为生物医药产业发展的热点，其中包括生长因子、细胞因子、单克隆抗体和酶等［1］。然而，多肽作为药物注射入生物体内时存在很多问题，如免疫原性强、半衰期短、酶解性强及溶解度较低等。其中半衰期短问题严重制约了小肽类药物的发展，这主要是由于分子量低于肾小球过滤阈值（阈值约60-70 kD），使得血液中的药物在通过肾脏时快速被清除，从而大大降低了多肽类药物的在血浆的半衰期［2］。因此，需要提高用药的剂量以及用药频率来维持药物在体内的有效浓度，这样给患者增添了许多苦恼。PEG 化（PEGylation）是20 世纪70 年代后期发展起来的一项热门蛋白修饰技术，PEG 是一类高分子多聚物，目前广泛应用于多种蛋白质药物或非蛋白质药物的修饰，可以有效地增加小肽类药物的流体力学体积，延长在体内的半衰期［3-5］。但是近期的研究发现，经PGE 修饰的药物在患者长期治疗过程中会导致一系列问题，如肾脏空泡化和聚合物在体内积累［6］，甚至有报道称在生物体内发现了PEG 生物制品抗体［7-10］，这些都使得PEG 药物安全性引起广泛的关注。

PAS 蛋白修饰（PASylation）是近几年发展起来的融合蛋白修饰的技术，在蛋白类药物的N 端或者C 端连接由脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）组成的序列进行融合表达［11］。PAS 序列是亲水、不带电的生物聚合物，具有与聚乙二醇（PEG）非常相似的生物物理性质，可以形成一个天然的非结构多肽链，并且具有大的流体力学体积和较高的溶解度。与PEG 化学修饰相比，PAS 融合蛋白在细胞表面的受体摄取后会被胞内的溶酶体蛋白酶快速降解，有效避免了在细胞中沉积。此外，PAS 序列是由3 个天然氨基酸组成的，且形成的高级结构较简单，因此适用于目前常见的生物表达体系，通过基因工程技术的生产方式可以大大减少成本［12］。目前PAS 修饰蛋白技术已被用于延长各种生物制品在生物体内的血浆半衰期，如抗体Fad 片段、生长激素、酶和干扰素等。

1 PAS 序列设计

1.1 氨基酸的选择

PEG 高聚物具有亲水性高，流体力学体积较大及不带电性的特点，为了使得组成的氨基酸序列具有类似的物理特性，首先将带电性的以及具有疏水性侧链且疏水性较强的氨基酸排除，在剩下的电中性且亲水能力较强的氨基酸中，其中天门冬氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸由于具有较强的趋势形成一个有规则的结构而被排除；组氨酸因为有较强的趋向与金属离子相互作用而被排除［11］，所以选中的3 个氨基酸分别是脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸。

1.2 PAS序列的顺序

在确定了构建序列的氨基酸种类后，对Pro、Ala 和Ser 这3 个氨基酸的排列顺序进行优化，使其所形成的高级结构与PEG 聚合物具有相似的无规则卷曲结构，并通过计算模拟其序列的混乱熵值使其达到较高水平［12］。例如，这3 个氨基酸在二级结构上形成功能结构的趋势应该尽可能相互消减，设计过程中要多考虑脯氨酸氨基端的反式异构结构，因为可以增加整条肽链的混乱熵值。此外，最大限度避免两个或者两个以上相同氨基酸的连接等，通过这些原则可以最大程度上避免α 螺旋，β 折叠等规则二级结构的形成［11］。

2 PAS 蛋白修饰技术的优势

2.1 蛋白PAS修饰有望取代PEG修饰

蛋白PAS 修饰是借助于天然氨基酸Pro、Ala 和Ser 组成的序列，在结构等物理特性方面参照PEG并通过与小分子多肽形成融合蛋白的形式而发展起来的蛋白修饰技术。PAS 修饰蛋白和PEG 蛋白聚合物具有相似的生物物理性质和结构特点：在生理的条件下，两者具有较高的可溶性，在溶液中都呈现出无规则卷曲的结构。因此，可以在不影响蛋白质功能的情况下增加其流体力学体积，从而显著延长了PAS 修饰蛋白的血浆半衰期。目前，在PAS 修饰药物分别对多个物种（如小鼠、大鼠、猪、狗和非人类灵长类）药理活性的检测中发现，PAS 修饰的药物除了保持PEG 修饰的优越性外，还弥补了其很多不足，如生产成本高、生物活性损失和安全性低等问题［13］。

2.2 生产成本较低

目前应用于临床药物生产的PEG 原料价格较为昂贵，而且在蛋白质药物PEG 修饰过程中的偶合和纯化步骤中活性损失率普遍较高［14-15］，因此大规模生产PEG 修饰多肽类药物成本昂贵，且工序较为繁琐。相比之下，因脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸这3 种氨基酸组合形成PAS 序列的高级结构较为简单，所以适用于目前所有常见表达系统，包括哺乳动物细 胞（CHO、HEK、COS）、 酵 母（Pichia pastoris、（Kluyveromyceslactis lactis）、大肠杆菌或革兰氏阳性菌等［11］，借助基因工程的手段可大大降低生产成本以及繁琐的生产工艺。

2.3 生物活性损失小

在PEG 修饰蛋白的过程中，通过Lys 侧链的修饰通常会降低药物的生物活性，如PEG 修饰的干扰素（IFNα2a）和白细胞介素-1 受体拮抗剂（IL-1Ra）等，与未经修饰相比，只保留了10%的活性［16-17］。目前，还未见通过PAS 修饰的蛋白药物药理活性损失的报道。

2.4 较高的溶解度

通过基因编码的PAS 序列在多种情况下都是单分散性的，有相关实验对相同分子量大小的PAS 和PEG 修饰的同种蛋白聚合物进行了物理性质比较，发现PAS 融合蛋白的黏度较低，比PEG 修饰的蛋白展现出更高的亲水性及溶解度［18］。这大大增加临床上注射给药方式的效率。同时，在大量的动物实验中观察到，通过皮下或肌肉注射的方式，PAS 修饰药物展现出了更高的生物利用度［12，19］。

2.5 生物安全性

早期的研究认为，PEG 是通过保护非本体蛋白质不受机体中的抗体或免疫细胞监管来降低药物免疫原性的，一直认为是生物惰性材料［20］。然而随着越来越多的PEG 化药物进入临床应用，关于患者体内抗PEG 抗体的产生并造成药效损失的报道不断增多［7-10］，加之PEG 是一种高聚化学分子，生物降解性较低，长期服用后会导致PEG 在体内的沉积，引起细胞空泡化，对组织造成不可估量的损伤。最近，美国食品药品监督管理局（FDA）对9 种已上市PEG 修饰蛋白药物进行审查，结果发现Omontys、Cimzia、Macugen、Krystexxa 和Somavert 这5 种药物可以促使细胞空泡的形成，还发现细胞中空泡出现的频率与PEG 在体内的累积剂量成正相关［6］。例如，PEG 修饰的Fab 片段cimzia，按照每次400 mg 的剂量，两周给药一次的频率，一段时间后分别在肝内巨噬细胞，库普弗细胞以及脾内网状内皮细胞等吞噬细胞中出现PEG 沉积。此外，在肾小管上皮细胞和脉络丛上皮细胞中也观察到了空泡的形成［21-22］。欧洲药品管理局（EMA）也下达了针对儿童人群谨慎使用PEG 修饰药物的指令［23］。相比之下，P、A、S 这3 个氨基酸自身属于生物体的天然物质，通过PAS 修饰的小分子药物在血浆中不具有免疫原性且稳定性强，重要的是在相关细胞摄取后，它们很快被细胞内溶酶体蛋白酶降解，有效防止了在细胞的空泡化。

3 PAS 蛋白修饰技术的应用

3.1 蛋白质药物的修饰

目前，PAS 技术已成功应用于很多功能性蛋白的修饰，包括人生长激素（hGH）［24］、IFN-α2b 抗体片段［11］、IFN-β1b 抗体片段［25］、瘦素［19，26］、红细胞生成素（EPO）［27］和白细胞介素-1 受体拮抗剂（IL-1Ra）［12］等，这些修饰后的蛋白均显著增加了流体力学体积，延长了其血浆半衰期，提高了多肽药物的药理活性。

3.2 Fad抗体片段的修饰

位于单克隆抗体（mAbs）上的抗原结合片段（Fabs），因其可以有效的识别癌症的一些标志性的抗原，并成功应用于一些肿瘤的治疗中［28-29］，所以是目前增长最快的一类生物治疗药物。其中有一些带有放射性的Fabs 免疫偶联物，如Zevalin，在临床治疗中的肿瘤靶向性方面具有广阔的应用前景，但是由于它们体积较小，肾脏清除速度很快（在人体内为数分钟到数小时），通常会导致示踪剂在靶向肿瘤组织的积累不充分，从而导致肿瘤成像不均匀且具有较高的背景信号等缺点［30-32］。而经PAS 修饰过后的αher2-Fab 抗体片段，增加了在体内的半衰期，优化后肿瘤成像中信号与背景成像比例提高到原来的12.2 倍［33］。从高效和安全性的角度来考虑，PAS对抗体片段的修饰在肿瘤成像和诊断的应用中有着广阔的前景和巨大的应用价值。

3.3 纳米载体的修饰

有报道称，用PAS 修饰的铁蛋白做纳米载体并成功靶向递送了阿霉素［34］。铁蛋白是一种机体内贮存铁的可溶组织蛋白，可以选择性地结合到转铁蛋白受体I 上［35］。铁蛋白N 端与40 个残基的PAS 序列相连组成的融合铁蛋白，与未经修饰的铁蛋白相比，提高了其稳定性和溶解性，铁蛋白装载药物的回收率从50%提高到了95%。同时，PAS 序列增加了蛋白的产率，每1 L 大肠杆菌培养物的产量增加约100 mg。此外，还发现PAS 修饰的铁蛋白对阿霉素的载药量增加了3 倍，并极大程度提高了稳定性，在4℃条件下，PBS 中储存3 个月后无沉淀析出，药物泄漏量仅为10%，而在未经修饰的铁蛋白中，在仅两周后就可以达到50%泄漏量［34］，可见PAS 对纳米载体的修饰可以大大增加其稳定性。

3.4 融合蛋白linker

由于P、A、S 这3 个氨基酸及其序列顺序可以形成一个无序卷曲的结构，在二级机构上避免了功能性结构区域的出现，从而最大限度保持了本体蛋白功能的完整性［11］。因此可作为linker 用于多个功能蛋白的连接，这样不但可以作为活性增强的生物技术催化剂用于工业化生产，而且可以用于一些复杂疾病的治疗。例如，通过PAS 序列（60）将左旋二酮还原酶与ω-氨基转移酶连接进行融合表达，虽然这种融合肽与单个生物的催化酶活性相比略有降低，但是在异山梨酯等工业相关氨基醇的制备过程中的氧化耦合以及转氨化反应中，与平时工业生产中所用的分离酶混合物相比，其活性得到显著的增强［36］。除此以外，GLP-1 类似物exextin-4 通过PAS（600）序列与胃肠激素肽YY3-36 融合表达，这种融合肽除了保留这两种肽各自的活性外，还将其在小鼠的血浆半衰期延长到16 h。目前，在慢性代谢紊乱、糖尿病及肥胖症等复杂疾病中，单一药物治疗的效果往往不尽人意，相比之下，联合作用药物的治疗有更强的优势［37］。通过PAS 序列连接，并借助生物技术工程的手段生产多功能的融合肽具有高效、廉价和简单等优点。目前，PAS 序列作为linker用于多个功能蛋白的连接还在不断地被探索，无论对于工业生产还是药物研发都有着巨大的潜力和经济价值。

3.5 其他多肽血浆半衰期延长的修饰技术

除了基于不带电性的PAS 多肽蛋白修饰技术之外，近年来还出现了与阴离子氨基酸组合而成的聚合物进行融合表达，由于肾基底膜带负电荷，从而通过与肾基底膜形成相互排斥的作用力来减缓肾代谢速率，增加药物在血浆中的半衰期［38］。例如，胶状蛋白质聚合物（GLK），它是由P、S、G、N、Q、E、K、A 等阴离子氨基酸组合而成的短肽链，粒细胞集落刺激因子（GCSF）在N-端结合116 个残基的GLK 短肽后，其融合肽产物通过皮下注射的给药方式，发现经修饰过的GCSF 在小鼠体内血浆半衰期增加到5.7 倍［39］。目前已知GLK 融合蛋白只适用于毕赤酵母，在大肠杆菌中的产量非常低，其他表达系统中还未见报道［40］。XTEN 也是整体带负电荷且应用较广泛的非结构多肽，XTEN 多肽由P、E、S、T、A、G 等氨基酸组成，目前已成功应用于人体生长激素［41］、凝血因子VIII、IX［42］、胰高血糖素［43］、胰高血糖素样肽类似物［44］及exenatide［42］等。例如，在人体生长激素连接一定长度的XTEN 多肽，通过皮下注射后可将药物半衰期延长到100 个小时，是未修饰人体生长激素的55 倍［41］。在胰高血糖素的C-端连接144 个残基的XTEN 多肽后，同样是通过皮下注射的方式给食蟹猴进药，将半衰期延长到6 h［43］。但是，由于XTEN 序列本身带有较高的负电荷，在与肾基底膜产生相互排斥的同时，也会改变被修饰蛋白的带电性，从而导致与其细胞表面受体的亲和力下降，药物的药理活性损失较大。例如，经XTEN 修饰过后的胰高血糖素只保留了最初活性的15%［43］。此外，人血清蛋白（HSA）是人体血液中含量最高的单一蛋白，具有无免疫原型，人体相容性好，血浆半衰期较长等优点，因此融合后可延长药物半衰期，目前公布的临床结果表明HSA-IFNα融合蛋白Albuferon 的半衰期长可延长到145 h，并进入了II 期临床研究［45］。但由于人血清蛋白的结构较为复杂，其制备纯化工艺较为繁琐且活性损失较大，这一缺点限制了其在市场的广泛流行。另外，多聚唾液酸是N-乙酰神经氨酸的多聚分子，可用作蛋白药物的缓释材料，由于多聚唾液酸本身的功能，因此在神经修复，神经创伤愈合等材料的修饰中具有广阔的前景［46］。

4 总结与展望

综上所述，PAS 修饰是一项比较新的技术。目前，已成功应用于多种功能肽的修饰，有效提高被修饰蛋白在血浆中的半衰期，增加药理活性。这种借助于天然氨基酸，形成具有与PEG 聚合物类似结构的蛋白修饰的方法，目前还在被进一步探索，并被认为是最有前景的可以替代聚乙二醇化蛋白修饰技术。与其他基于多肽的氨基酸修饰技术相比，PAS 序列的不带电性和形成无序环状结构等特性方面与PEG修饰最为相似，因此具有几乎相同的生物物理特性。而PAS 修饰与PEG 修饰相比，前者可借助现代生物工程技术进行融合表达来实现；与PEG 的化学偶联修饰相比，PAS 修饰技术在生产和应用方面变得简化和廉价，更重要的是，天然氨基酸成分在体内的无痕迹代谢也为PAS 修饰药物应用提供了一个更好的前景。

目前，PAS 融合序列已被应用到蛋白修饰的多个领域。PAS 修饰的多肽类药物在体内成功增加了其血浆半衰期，提高药物的药理活性，并被广泛的应用于多种生物制剂。同时，PAS 修饰技术在体内肿瘤成像和药物传递系统中也有着极高的应用价值，如PAS 修饰后的抗原结合片段，可以在没有相关副作用的前提下优化了肿瘤成像，经PAS 修饰过后的铁蛋白纳米载体，载药量及其稳定性都大幅度提升。此外，PAS 序列作为linker 被应用在联合作用药物中，如双功能肽，这样不但简化制造过程，降低了成本，又延长了体内循环时间，因此PAS 序列在多功能融合蛋白的是生产中具有较高的应用价值。综上，随着PEG 修饰药物的弊端不断被发现，寻找PEG 化以外的更为安全有效的方法是非常有必要的。而PAS修饰在弥补了PEG 修饰不足的同时，在许多方面都展现出与PEG 化有着近乎相同的特点，与其他多肽修饰技术相比，其简单的制备工艺也非常有利于大规模的生产，同时应用也较为广泛。因此，PAS 修饰技术对小肽药物的发展有着巨大的潜力。但PAS修饰技术是一项新兴的技术，对其探索还未成熟，我们需要进一步了解PAS 的长度与被修饰蛋白的关系以及PAS 这3 个氨基酸分别在被修饰的多肽中所起的功能作用，这样可以在小分子药物的发展中发挥出更大的优势。