植物固氮细胞器的合成生物学研究

罗利

（上海大学生命科学学院，上海 200444）

从1960年代开始，世界范围内的氮肥消耗量增加了13%，现在每年合成量接近100 Tg（Terrogram，1012g）；禾谷类有效利用氮肥的效率由约80%降至约30%，约有60%（每年近1亿吨氮肥）流失于陆地和水体环境，造成土壤板结、酸化，重金属离子释放，导致严重的环境问题，威胁农林牧业的可持续发展。其中，约有40%的氮肥通过反硝化作用转变成氮气回到空气中，浪费了全球能源供应的1%；而反硝化过程产生的N2O是一种潜在的温室气体，其对全球变暖的危害约是等量CO2的300倍。可见长期大量使用化学氮肥将对生态系统平衡和人类社会的可持续发展造成严重威胁。

1 生物固氮作用

在哈珀合成氨技术发明之前，自然界的化合态氮素形成主要通过原核生物（包括细菌和古菌）的生物固氮作用和闪电或者火山喷发形成。生物固氮作用即原核生物中的固氮酶系在厌氧或者微氧以及常温常压条件下将空气中单质氮气转化成氨的过程，是自然界化合态氮素形成的主要途径。生物固氮作用包括自生、联合和共生3种形式。自生固氮作用即固氮微生物在厌氧条件下固定氮素供给自身使用，如念珠蓝细菌（Nostocsp.）、维氏固氮菌（Azobacter vinelandii）和类芽孢固氮菌（Paenibacillussp.）等。联合固氮作用，即固氮微生物生活在一些植物的体表或者组织间隙，利用植物光合产物作为碳源，固定氮素主要供给自己使用，多余的提供给宿主植物，如巴西固氮螺菌等。全球的联合固氮细菌年固氮总量约50-70 Tg。共生固氮作用，即固氮微生物在根瘤器官的植物细胞中，利用宿主光合产物作为能源，固定氮素支持宿主生长发育，如根瘤菌-豆科植物、弗兰克氏菌-桤木和蓝细菌-澳大利亚苏铁等。全球豆科植物-根瘤菌共生固氮作用的年固氮量约21.5 Tg［1］。可见，自生和联合固氮微生物的固氮总量较共生固氮微生物要高，但是就单一固氮系统的效率和对农牧业生产的贡献而言，共生固氮作用要远高于自生和联合固氮作用。但是共生固氮系统的主要问题是固氮微生物的宿主专一性，即特定的共生固氮微生物只能侵染特定种属的宿主植物，不能侵染其它种属的植物。以苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）为例，其只能侵染苜蓿属（Medicago）、草木犀属（Melilotus）和葫芦巴属（Trigonella）豆科植物。而广谱根瘤菌SinorhizobiumNGR234则可以侵染多达上百种豆科植物，形成固氮根瘤。然而，作为人类主要粮食来源的禾谷类作物如水稻、玉米等，却不能与固氮细菌形成共生关系，依靠共生固氮作用获得氮源。因此，突破共生固氮细菌的宿主专一性，在禾谷类粮食作物中合成固氮细胞器，对农业、环境和社会的持续发展意义巨大。

随着合成生物学的兴起，以系统生物学为基础，以工程学为指导，将标准化、解偶联、模块化和可组装性等原则引入遗传工程研究领域，降低生物系统的多样性和复杂性，从而实现对生物系统（基因遗传线路）的人工设计和定向改造。目前，合成生物学研究已取得突破性进展，如成功设计出了生产青蒿素的酵母细胞，实现了细菌基因密码子的重排和酵母染色体的简化，化学合成了细菌和酵母基因组，合成携带最小基因组的衣原体等［2-6］。

近年来，国内外的研究者将合成生物学原理引入了生物固氮研究领域，形成了固氮合成生物学的新领域，为植物固氮细胞器的人工合成奠定了基础。本文就近年来固氮合成生物学的主要研究进展作简要综述，并针对相关问题提出一些看法和设想。

2 固氮合成生物学研究进展

早期的固氮合成生物学研究可以追溯到1970年代，研究人员首次将肺炎克氏杆菌（Klebsiella oxytoca）nif基因簇导入大肠杆菌（Escherichia coli），测出了固氮酶活性［7］。最近，Liu等［8］将固氮蓝细菌Cyanothecesp. ATCC 51142中的35个固氮相关基因导入不固氮的蓝细菌Synechocystissp. PCC 6803中，测出了30%的固氮酶活性。同时他们还发现，通过提高nif基因的表达量可以增强固氮酶活性；表达吸氢酶基因则可以提高固氮酶对氧气的耐受性。

随着分子遗传学的快速发展，固氮基因的表达调控研究取得了重要进展，鉴定到了氮调节系统NtrB/NtrC、微氧调节系统NifL/NifA和FixL/FixJ，特别是固氮正调节nifA的特性如温度敏感性等研究结果［9-10］，为固氮基因的工程化应用提供了理论依据。20世纪90年代，研究人员尝试着在固氮细菌中异源表达固氮正调节基因nifA，提高固氮效率。中科院上海植生所的沈善炯实验室成功地构建了组成型表达肺炎克氏杆菌（K.oxytoca）NifA的大豆根瘤菌工程菌株，在随后的接种实验中显示了良好的增产效果［11］。

真正将合成生物学规则引入固氮遗传工程研究始于2012年，Voigt实验室首先报道了肺炎克氏杆菌（K. oxytoca）固氮基因簇重构［12］。他们应用自下而上的方法重建了nif基因簇，表明了合成生物学工具在生物固氮工程化应用中的潜力。但是，细菌固氮基因簇向真核生物的转移，并获得具备自主固氮能力的作物进展并不大。

2.1 固氮酶基因簇的细胞器转移及适配性研究

由于固氮酶对氧气具有极端的敏感性，因此，天然生物固氮系统进化出了独特的氧保护机制。比如固氮蓝细菌通过空间隔离在异形胞中表达固氮酶或者在时间上通过生物钟调控将光合和固氮作用分开来避免光合作用产生的氧气对固氮酶的伤害；维氏固氮菌（A. vinelandii）和田菁根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）分别通过海藻酸氧扩散屏障作用以及固氮酶与特定的铁硫蛋白Shetna互作来保护固氮酶［13-14］；豆科植物固氮根瘤中通过宿主植物表达的豆血红蛋白结合和传递氧气，由于该蛋白对氧气分子具有极高的亲和力，所以共生植物细胞以及类菌体中氧浓度极低，从而保护固氮酶免受氧气的破坏。由此可见，在转基因植物细胞中直接表达固氮酶系，必需同时引入氧保护机制，否则固氮酶的生物活性必然被破坏。

于是，研究人员将目光转向了真核生物的两种半自主细胞器，质体/叶绿体和线粒体。它们作为生物固氮合成生物学研究的细胞器底盘具有较好的优越性。例如，二者均具有原核转录和翻译系统，允许利用细菌启动子表达以操纵子形式组织的固氮基因簇；局部产生固氮酶功能必需的ATP和还原力；母系遗传，避免重组基因通过受精扩散。在质体中，可以通过高效同源重组实现基因组定位的特异性；在线粒体中，含有Fe-S簇装配机器，呼吸作用导致基质氧气耗竭，为氧敏感的蛋白表达及发挥功能提供了可能［15］。因此，研究人员展开了以植物叶绿体或者酵母线粒体为底盘的固氮基因工程化研究。

早在2005年，Dixon实验室报道在衣藻质体中成功表达重组NifH蛋白［16］。2016年，Ivleva等［17］报道将nifH基因整合至烟草质体基因组，获得了NifH蛋白。但是，到目前为止尚未见将整个nif基因簇或者最小基因簇整合入质体基因组，并表达出完整的固氮酶的报道。

2016年，Rubio实验室报道在好氧生长的酵母线粒体基质中成功地表达了固氮酶铁蛋白NifH和成熟酶NifM，而在细胞质中表达NifH，除了厌氧条件还需要共表达NifM、NifU和NifS［18］。2017年，该实验室成功地在酵母线粒体中表达了9个维氏固氮菌（A. vinelandii）的nif基因（nifH、D、K、U、S、M、B、E和N），其中NifDK还形成了四聚体［19］。但是这些蛋白是否在线粒体基质中形成了有功能的固氮酶系有待进一步研究。另外，在植物细胞中尚未建立线粒体遗传转化技术体系。

天然固氮酶系发挥作用时，需要与电子传递蛋白（如电子供体蛋白）匹配，获得打开氮氮三键必需的高能电子。那么植物中质体、叶绿体或者线粒体等细胞器中是否有相应的功能蛋白提供电子支撑固氮酶发挥作用呢？这是固氮合成生物学研究中一个重要问题。2017年，北京大学王忆平实验室［20］应用合成生物学模块化方法评估了来自于叶绿体、根质体和线粒体中充当Mo固氮酶和Fe固氮酶的电子供体，发现来自于植物叶绿体的电子转移组份能够用来支持约30%的固氮酶活性。该研究结果提示在植物中工程化固氮酶的目标基因数量可以减少。

2.2 固氮酶基因簇及其调控回路简化

固氮微生物中固氮（nif）基因簇一般由十几到二十几个基因形成多个操纵子，其表达受环境因子如温度、化合态氮和氧气浓度调节。大量的编码基因和复杂的调控区不利于合成生物学操作。因此，研究人员一方面致力于寻找具有简约固氮基因簇的固氮系统；另一方面应用合成生物学方法对熟知的固氮基因簇进行简化。这两个方面目前均取得较好的进展。2013年，中国农业大学陈三凤实验室报道一种固氮类芽孢杆菌P.WLY78，其固氮基因簇由9个基因组成，包括nifB、nifH、nifD、nifK、nifE、nifN、nifX、hesA和nifV。将该基因簇转移至大肠杆菌中，合成了具有一定催化活性的固氮酶［21］。2016年，该实验室从P.sp.WLY78和K.oxytoca中选择了28个基因分别置于两个质粒上受类芽孢杆菌nif启动子控制，在大肠杆菌中进行表达，发现类芽孢杆菌suf操纵子（Fe-S簇装配）和潜在的电子传递基因spfoAB，fldA和fer增加了固氮酶活性；K. oxytoca的nifSU（Fe-S簇装配）和nifFJ（固氮酶特异的电子转运）也能增强固氮酶的活性；混合装配类芽孢杆菌潜在的电子转运基因（pfoA/B，fldA）和K. oxytoca nifSU可以将固氮酶活恢复到野生菌的50.1%。这些研究结果显示辅助铁硫簇装配和电子传递的蛋白质对于固氮酶活性的提高至关重要［22］。

北京大学王忆平实验室在肺炎克氏固氮菌（K.oxytoca）固氮基因簇的简化方面做了系列工作。2013年，该实验室报道应用改造的T7启动子可以平衡表达nif操纵子，并去除了固氮基因的天然调控回路。而且在大肠杆菌（E. coli）中，用不同强度的T7启动子获得不同表达水平的固氮酶，其活性可以达到天然固氮酶系的42%［23］。该工作简化了固氮基因调控回路。2014年，该实验室在大肠杆菌中工程化一个Fe-Fe固氮酶系统，通过融合anf结构基因和附属的nif基因，形成了一个少至10个基因组成的固氮基因簇，成功表达具有活性的Fe-Fe固氮酶［24］。该工作简化了固氮基因簇。2018年，该实验室发明了一个病毒来源的多蛋白“融合和剪切”的技术体系，将14个固氮必需基因选择性地装配形成5个巨大基因，减少了基因数量，固氮酶的各组份平衡表达，具有生物活性，工程细菌能够以氮气为氮源生长繁殖［25］。该研究创造了一个固氮基因的简化工具，同时简化了固氮基因的组织形式。

2.3 病原细菌共生功能的人工进化

随着豆科植物-根瘤菌共生互作机制研究的不断深入，很多研究者已经意识到共生结瘤固氮，至少包括根瘤菌原基起始和根瘤菌侵染两个协调的过程，而后一个过程与宿主免疫控制机制关联。因此，有研究者提出了新的固氮合成生物学思路，即以植物病原菌为底盘，通过人工进化使其获得结瘤和侵染能力。2010年，Marchetti等［26］报道对携带有根瘤菌Cupriavidus taiwanensis共生质粒的病原菌Ralstonia solanacearum进行人工进化，通过失活T3SS的hrcV基因，工程菌株在Mimosa上发生早期侵染事件，并且结瘤；而失活毒性调节基因hrpG则促使工程菌株对根瘤细胞进行胞内侵染。2013年，同一实验室对相关研究结果进行了验证［27］。但是没有后续固氮酶表达和活性水平的结果。该研究显示T3SS系统在细菌与宿主植物共生互作时抑制宿主免疫反应方面发挥了重要作用。一些大豆根瘤菌T3SS的结瘤功能研究和广谱根瘤菌S.NGR234的T3SS效应子的遗传学研究也支持这一推测［28-29］。有趣的是，除了通过定向筛选将根瘤菌共生质粒转移至病原细菌以外，在自然界还存着共生质粒的水平转移现象［30］，这说明共生质粒完全可以进行合成生物学操作。

2.4 禾谷类作物的共生功能改造

通过对模式豆科植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和百脉根（Lotus japonicus）的遗传学和生物化学研究成功地鉴定了结瘤因子（Nod factor）的受体激酶MtNFP1/LYK3和LjNFR1/NFR5、钙离子通道蛋白DMI1、钙调素依赖的受体激酶DMI3以及转录因子 NSP1、NSP2、NIN和 ERN1等［31］。丛枝菌根共生研究显示其与结瘤共生存在部分相同的信号传导途径，而丛枝菌根共生的植物包括禾谷类作物等绝大多数的陆生高等植物，为应用合成生物学工具，将豆科植物结瘤共生系统移入非豆科植物提供了可能性［32］。目前，已有华中农业大学张忠明实验室报道获得了百脉根共同结瘤信号途径基因（LjLHK1、LjNSP1、LjNSP2和LjNIN）的转基因水稻，并对转录组的变化进行了分析［33］。

3 展望

近年来，固氮合成生物学研究取得了良好的进展，如北京大学王忆平实验室在固氮酶基因簇的简化方面，Rubio实验室以酵母线粒体为底盘的固氮酶基因的表达方面均取得出色的研究成果。但是固氮合成生物学的发展也面临不少困难和障碍。

首先是固氮酶的氧敏感性和固氮酶系合成控制的复杂性问题。自然固氮系统进化出了多种氧保护机制，固氮合成生物学如何建立氧保护系统。例如，将简化的固氮酶基因簇导入叶绿体基因组，表达的固氮酶，如何避免氧破坏？建立隔离空间还是时序控制，这些均涉及到叶绿体发育机制，属于叶绿体基础生物学范畴。研究者认为线粒体基质具有低氧属性，有利于固氮酶的氧保护作用，但是并未见到固氮酶活性的报道，而且我们对植物线粒体的理解还是非常有限，遗传操作技术几乎是空白。

另外，固氮酶基因的表达调控是固氮细菌物质、能量代谢和信号感受控制网络中一个子系统，该网络实时感受环境信号变化（化合态氮、氧气、温度、pH、渗透压和生物钟）调节固氮酶基因表达，最大限度的减少能量和物质浪费，达到自然经济目标。固氮反应毕竟是一个高耗能过程，能量的输入与氮素的输出，受细胞器和细胞的稳定性与宿主生长发育需求塑造。合成生物学如何能使固氮酶基因的表达适应细胞器、细胞和宿主的生理状态变化，这些都是必须考虑的基本理论问题。

其次，在豆科植物-根瘤菌共生固氮体系中，尽管我们对结瘤因子的信号传导已经有了相当的认识，如受体激酶、钙离子通道和钙调素结合蛋白以及和各种转录因子等，但是该结瘤因子信号传导途径也只是共生固氮信号网络的一个子系统。合成生物学试图利用已经存在的共同结瘤信号途径，在禾谷类作物中重建这一系统，最大的问题是如何与内源的信号系统耦合，如内源植物激素、免疫信号系统的耦合，即使大量豆科植物特有的共生基因成功转移至禾谷类，且成功表达，能否形成早期的发育与侵染事件还有待进一步摸索。重要的是，人们并不清楚（1）根瘤菌在侵染过程中，宿主植物免疫反应的作用机制以及根瘤菌适应宿主免疫反应，控制自身分裂增殖的分子机制；（2）根瘤菌通过胞吞释放到根瘤植物细胞时的分裂控制机制；豆血红蛋白时空特异性表达，创造微氧环境的调节机制以及根瘤中分化的类菌体适应微氧环境的机制；（3）豆科植物种子灌浆时促进固氮根瘤衰老的生化机制等。这些基本理论问题都是发展固氮合成生物学所要考虑的。

最后，固氮合成生物学研究尚处于起始阶段，我国要想在这一领域引领世界，必须要有一个长远的规划，如建立多模块研究系统（如结瘤起始模块、侵染与免疫抑制模块、胞内信号感受与细胞分裂增殖控制模块和固氮与氮转运模块等），全国各研究单位分工协作，才有可能最终实现固氮细胞器人工合成的目标。