细胞梯度力学微环境体外构建的研究

王 琳,何 楠,李昱辉,周宝珍,李 娜

(1.西安外事学院a.医学院;b.生命科学应用研究中心,中国陕西西安710077;2.西安交通大学a.生命科学与技术学院;b.仿生工程与生物力学中心,中国陕西西安710049)

机体内的细胞处于一个由基质、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和细胞因子组成的复杂动态微环境中。ECM的理化性质、周围细胞的生长情况、各种生化因子的浓度及浓度梯度,都会对细胞活动产生影响。力学环境对于维持生物体特殊的生命活动不可缺少,力学环境的异常将全部或部分改变生命过程。如干细胞与其局部微环境相互作用,可调节细胞行为并指导其发育过程,多能干细胞的微环境调节其自我更新与分化[1]。许多疾病的发生发展与细胞力学微环境的异常密切相关。例如:心肌在受损时会发生心肌纤维化,过度表达胶原并沉积,导致ECM刚度升高,引起心肌细胞表型转化,心肌纤维化程度加重[2～3]。此外,微环境力学特性的非均匀性在细胞相互作用等行为中也发挥着重要的作用。例如:细胞迁移是组织修复过程的关键行为之一。在均匀环境中,细胞呈现无规律迁移运动,而在具有一定力学梯度的环境中,细胞膜和细胞骨架会重新排布,细胞呈现显著差异的极化状态[4]。Movilla等[5]通过微流体实验发现,改变水凝胶的浓度,会影响成骨细胞的迁移模式,并最终影响骨的再生。微环境中的细胞因子梯度在多种生理和病理现象中起重要作用,例如:免疫应答、伤口愈合、发育和癌症转移[6]。Vining等[1]制作了一种模拟干细胞微环境的模型,该模型可精确控制干细胞微环境的生物物理和化学性质,并确定基质刚度等大小,以用于支持干细胞再生疗法。因此,构建细胞梯度力学微环境并探索其对细胞调控作用的研究已受到越来越多的关注。

1 细胞力学刺激

根据功能和所处位置的不同,细胞暴露在不同的力学刺激中,既有外部的,也有内部的。外界机械刺激一般包括静水压、剪切力、压力、牵张力以及高频振动等;内部刺激主要由细胞骨架牵拉胞膜和细胞器而产生。本文主要介绍刚度和拉压应力两种力学刺激。体细胞可被动感受周围ECM刚度、粘弹性等力学信号,从而影响黏着斑和配体的结合,进一步调控细胞黏附、细胞骨架组装和解离、细胞分化和增殖等行为;也可主动感受微环境中存在的多种应力刺激,如拉应力、压应力、流体剪切应力等,从而调控细胞行为。

1.1 刚度(stiffness)

细胞与ECM构成的界面是实现细胞正常生理功能的主要支撑。为了保持细胞活力,正常组织细胞必须附着在天然的ECM或工程支架上[7]。人体内不同组织中ECM的刚度不同,如神经、脂肪等软组织中,ECM的刚度小;在牙齿、骨等硬组织中,ECM的刚度大[8]。随着人体生理过程以及病理过程的变化,组织ECM的刚度会发生改变。而且,ECM刚度小的组织易发生变形,刚度大的不易发生变形。ECM的这种力学性质影响了细胞的生物学行为。研究发现,细胞是通过感受施加在黏附配体及肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架上的力而获知ECM的刚性,再通过黏着斑-整合素将信号传递到相邻细胞和ECM,构成信号网络,实现对细胞特异性调控[9]。基质刚度不仅对细胞的黏附、铺展、分化、迁移行为具有调控作用,比如:生长于给定刚度基质的上皮细胞在迁移到新的刚度基质上时,相对于软ECM其迁移速度更快,这也说明细胞对基质刚度有“机械记忆”[10];而且对细胞的发育、再生以及疾病的发生发展同样发挥重要的作用[7],例如:病理状态下,癌症组织的ECM刚度会比正常组织高出5～20倍[11]。

1.2 拉压应力(tensile/compressive stress)

机体细胞处于一个复杂应力刺激微环境中,而拉压应力普遍存在于多种细胞的增殖、生长发育以及凋亡等重要生理活动中。例如:在骨骼肌收缩、血管收缩过程中,细胞时刻都会受到拉伸力刺激作用;在软骨发育中,软骨组织常常承受来自周围组织一定大小和频率的压应力,而压应力可使软骨细胞发生形态和结构的改变。此外,拉压应力刺激对心肌组织结构和功能的影响亦较显著。例如:宏观上心脏会受到泵的牵拉或按压作用,微观上心肌细胞会受到ECM的牵张和压缩、细胞自身的内张力作用。这些力学刺激对于维持细胞各自特殊的生命活动不可缺少,而力学环境的异常也将全部或部分改变其生命过程。比如:高血压患者血压长期处于较高水平,对血管壁产生的压应力可激活跨膜蛋白,进而上调促血管内皮细胞增殖的蛋白激酶,最终引起血管结构与功能的改变[12]。又如:长期卧床病人因缺乏运动,骨组织及骨细胞缺少适当力学刺激,在骨改建过程中破骨细胞活性增加,骨组织减少,同时也会诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化[13]。因此,拉压应力在机体正常生理和病理过程中均发挥重要作用。

2 细胞力学微环境构建及表征方法研究

为了探索细胞生理及病理发生的本质,在体外构建模拟体内细胞生存的微环境成为一种有效的研究手段,常用方法是二维和三维细胞培养。目前,针对不同研究对象和研究目的,采用先进微/纳米制造技术已开发出基于不同基质材料、不同力学刺激方式的体外二维、三维细胞微环境模型。其中三维模式更接近细胞生存环境,这也将推进组织再生、组织体外模型、大规模细胞分化、免疫疗法和基因治疗等领域的发展,但细胞微环境中的化学、结构力学和电生理学的变化依然是最大的阻碍[14]。尽管如此,研究人员依然力求通过体外模型的构建能够揭示细胞内力学信号传导通路及细胞行为力学的调控机制。

2.1 基于基质材料的研究

基质材料的选择与研究目的密切相关,既应能为细胞和组织提供结构支持,同时也应实现细胞与基质间信号的传导。基质材料刚度对细胞的黏附、铺展、增殖、迁移和分化等功能与行为影响显著,其可调控性在微环境构建中十分关键。基质材料按来源可分为天然生物材料(胶原、藻酸盐等)、人工合成生物材料(玻璃、陶瓷等)以及复合生物材料(有机材料和无机材料的复合、生物性和非生物性材料的复合等)。由于基质材料表面的一些化学官能团、亲疏水性及带电性会影响细胞的黏附作用,因此用于模拟体内ECM的材料应尽可能具备生物相容性、功能相似性等。目前,研究人员常常采用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)印章法[15]、光刻法[16]、微流控阵列法[17]等特殊工艺在基质材料表面进行活化或修饰活性分子,使其更利于细胞黏附。同时,基质材料还应具有良好的力学性能,便于精确调控和模拟基质的力学范围。由于机体不同组织的刚度不同,因而在研究牙齿、骨、软骨组织等ECM刚度较大组织的细胞力学行为时,宜多选择刚度较大的玻璃、硅片、陶瓷、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)和PDMS等基质材料;而在研究肌肉、脑、神经等软组织的细胞力学行为时,宜多选取胶原、明胶、水凝胶、聚合物支架等刚度较小的基质材料。Qing等[18]利用还原石墨烯-电纺丝纳米纤维复合支架诱导SH-SY5Y细胞的定向生长与分化,此模型在神经性疾病损伤治疗中有着巨大潜力。此外,在基质选择中,还需注意ECM和各种组织间所具有的粘弹性和随后的应力松弛。比如:Bauer等[19]为了测试应力松弛对成肌细胞的影响,制备了一组具有不同的初始弹性模量和松弛率的二维RGD(Arg-Gly-Asp peptides)藻酸盐水凝胶基质,发现在应力松弛水凝胶基质上培养的成肌细胞的扩散和增殖能力均强于具有相同初始弹性模量的纯弹性基质上的细胞。总的来讲,研究者可以通过选取不同的基质材料,构建具有不同刚度的体外微环境,从而开展体外研究并获得刚度对细胞行为的影响机制。

2.2 基于力学加载方法的研究

由于细胞在体内受到的应力种类(拉应力、压应力、流体剪切力等)、作用时间(长期、短期或静态、动态)、作用频率(高频、低频)、作用方式(单一效应或联合效应)各不相同,因此需要在体外搭建特定的应力加载平台,进而探讨不同细胞对机械应力的响应机制。现有的力学加载方法和装置依据不同研究目的和研究对象有不同分类:根据研究对象水平不同,可分为单细胞或单分子水平(光镊[20]、磁镊[21]、玻璃微管[22]、微流控芯片[23]、分子梳[24]、原子力显微镜[25])和多细胞、微组织或组织水平的力学加载方法;根据力学性质不同,有拉伸装置、压缩装置、灌流装置、离心装置等加载装置;根据力学刺激方式不同,分为循环刺激、单一刺激、高频刺激、低频刺激、单向刺激、双轴刺激等;根据研究对象数量不同,可分为高通量和低通量。ECM是细胞活动的基础,可将微环境中力学信号传递给细胞。因此,体外对基质材料施加力学载荷,成为探索细胞对拉应力、压应力反应机制的理想研究手段。其中,Flexercell力学加载系统就实现了对载细胞基质的循环拉伸(压缩)模拟[26]。Lee等[27]采用Flexercell力学系统发现5%应变的循环拉伸加载可促使人韧带成纤维细胞沿主应力方向排列,同时胶原蛋白表达水平增加。目前,也出现了在空间和时间产生动态刺激的单细胞分析的微流体平台,其结合了活细胞成像系统,可实时观察细胞的动态反应[28]。虽然很多种力学加载装置已经问世,但这些装置都各有优缺点,在应用范围上也存在相应局限性,难以模拟体内组织真实受力情况,因此仍需开发更多力学加载装置和方法,从而实现更精准和更可控的加载条件的调控。

2.3 细胞微环境力学表征

对于细胞所处的复杂的力学微环境,人们主要通过基质材料的力学特性、细胞力学行为以及细胞-基质界面力学特性的测量三方面来表征,同时研究人员也希望应用大量的数学模型来揭示微环境中细胞行为改变的生物物理机制[29]。三方面表征的具体表现如下:1)基质材料力学特性表征:基质刚度通常采用弹性变形范围内测其杨氏模量(Young’s modulus)的方法来表征,在该方法中传统力学性能测试机、微纳压痕仪、原子力显微镜等仪器可以满足测量需求;2)细胞力学行为表征:目前针对细胞拉应力的表征方法包括硅胶薄膜测量法[30]、显微镜技术[31]、微组装悬臂梁[32]等。其中,硅胶薄膜测量法仅限于特定细胞,存在薄膜变形非线性、分析困难等局限性。早期拉应力显微镜技术主要通过测量修饰和包埋的荧光粒子的位移改变,分析计算基底弹性材料变形的应力/应变信息,从而反应二维环境中细胞所产生的拉应力。牵张力显微测量技术不仅可实现单个细胞拉应力的研究;而且通过整合现有技术还可实现细胞-细胞以及细胞群拉应力的研究。此外,通过整合激光共聚焦荧光显微镜技术,人们实现了三维细胞组织拉应力的测量,但该方法常常需要自主开发图像分析及计算程序。水平微组装悬臂梁技术的检测结果是一维尺度的,因而催生了垂直微柱力传感器阵列技术。该方法通过微柱弯曲变形程度测定细胞拉应力,实现了二维空间上的拉应力测量。随着技术进一步发展,研究人员构建了细胞生存的三维微环境,通过微柱弯曲变形测量细胞群的收缩力,证实了微柱阵列刚度对细胞行为的影响作用[33～34]。但该方法本身存在技术缺陷,因此三维环境中的拉应力测量方法还需提高和改进;3)细胞-基质界面力学特性表征:目前在分子水平研究细胞-基质界面力学特性的方法主要是荧光张力检测探针法,其通过检测荧光共振能量转移效率的变化,推测出细胞-基质界面力学的变化。该方法实现了整合素和基质蛋白的连接强度、细胞膜上力敏感蛋白的拉伸强度等分子水平的力学测试,对于探究细胞力学信号传导机制具有重大意义。

3 梯度力学微环境研究现状

体外细胞的力学环境调控研究,可通过改变细胞培养中所使用的基质材料的力学特性,或对培养细胞或组织模块施加不同大小、类型的力学刺激等方式实现。传统的二维细胞培养体系,虽可实现不同基质力学特性对细胞行为影响的研究,且方法简单、干扰因素少、研究因素单一,但难以模拟细胞在体内的三维环境,因此三维细胞力学微环境研究意义重大。另外,在组织形态发生和细胞内环境稳态中,力学信号并不总是均一的,而是存在一定梯度。这些力学信号的空间、时间梯度对细胞增殖、迁移、分化、炎症、损伤修复和癌症等各种行为影响显著,也日益成为研究热点。

3.1 刚度梯度研究

成熟机体中,骨、软骨、筋膜等不同组织界面的交界处常存在一定的刚度梯度。同时,细胞周围基质刚度的大小并不是一成不变的,而是随时间动态变化的,例如机体心外膜、密质骨的刚度从胚胎期到成年期会随时间逐渐增大。组织工程方法是在体外的生物材料支架中重现天然ECM的显著梯度特征,从而可更精确地调控细胞在梯度方向的黏附迁移和分化等行为。水凝胶是包埋细胞并调控三维细胞力学微环境时用得最多的一种生物材料。水凝胶中聚合物的浓度可影响水凝胶刚度,人们可通过改变水凝胶刚度探究刚度对细胞行为的影响。目前,大量研究已证实ECM的刚度梯度可调控细胞行为,影响细胞迁移、排列、分化、增殖和凋亡[35]。Sharma等[36]构建了(10～30)kPa、(30～50)kPa和(70～90)kPa 3种不同刚度梯度的水凝胶来模拟肌腱组织和类骨质的刚度,发现在(70～90)kPa梯度下的基质可诱导间充质干细胞向成骨细胞分化。Jeon等[37]通过构建模拟在体肌肉组织的刚度梯度,证实间充质干细胞具有向ECM刚度较大的方向迁移的趋势。目前已有多种基于水凝胶刚度梯度的微环境建立方法,如微流控法、光图形法及光交联法等。其中,通过在微流控流道两端加入不同单体(聚合物)浓度的凝胶前体溶液,并基于扩散效应形成具有刚度梯度的水凝胶方法,由于其扩散效应发生迅速,对通道长度有所要求,所以制备的样品尺寸较大;基于光刻技术并结合PDMS的光图形法构建的刚度梯度微环境,常存在刚度范围不连续且会发生突变的局限性,因此不适用于研究连续刚度微环境对细胞行为的影响[38];而基于呈灰度分布的光掩膜的光交联技术,适用于研究连续的刚度微环境对细胞黏附、增殖、迁移、分化行为的影响[39]。在组织工程和再生医学领域中,刚度梯度水凝胶的基础和临床医学的研究将进一步推动其发展,而且梯度刚度水凝胶的设计方法与应用系统也是现今的研究热点[35]。但总体来说,刚度梯度力学微环境的构建及调控方法研究仍处在初级阶段,还需更多探索。

3.2 应力/应变梯度研究

体细胞除感受ECM刚度特性外,还会感受到复杂的应力刺激。拉伸力学刺激在肌肉、结缔组织、肺、膀胱等较软的组织器官较为常见。目前,体外力学刺激研究体系主要是通过对载细胞基底(如水凝胶、高分子薄膜、PDMS等)进行拉伸载荷,进而对细胞施加均一分布的应力/应变刺激。然而在生理病理状态下,机体细胞所感受到的应力/应变刺激往往呈梯度分布,因此,开发应力/应变力学加载系统对于研究体内梯度力学刺激下细胞的行为功能具有指导性意义。Wang等[4]结合光刻技术构建了基于特异形状的水凝胶二维梯度应力/应变微环境加载方法,研究了梯度应力/应变刺激对C2C12细胞定向排列的影响。研究发现,细胞的定向排列与所受应变刺激大小密切相关,当应变大于一定值时,细胞会出现“应变避让”,也就是细胞排列的方向垂直于力学拉伸的方向;而应变小于一定值时,细胞排列平行于力学拉伸的方向。但是,体内大部分细胞是处于被ECM包裹的三维微环境中,且细胞在三维力学的刺激下,也表现出与二维培养完全不同的响应行为。Henshaw等[40]在研究循环牵张应力作用于胶原凝胶包裹的三维组织模型中的ACL成纤维细胞时发现,细胞排列的方向平行于力学拉伸的方向。目前,三维构建方法仍存在样品大、应变范围较小、低通量等局限性。因此,开发大应变、微尺度、高通量力学加载系统刻不容缓。一旦这些加载系统得到有效发展,将极大促进三维细胞力学微环境的体外构建,有助于模拟体内生理/病理状态,使力学刺激下细胞的行为响应结果更精确。

4 展望

组织工程和再生医学的目标是为了修复和替换器官而创建有功能的人体组织。为了实现这一目标,组织工程必须重建体内组织的物理、化学等特性,并复制细胞和微环境的复杂相互作用,从而调节组织形态发生、功能和再生。从传统组织工程的角度来看,梯度依赖的基底具有实验路线快速、单一的优势,从而可用于优化生物材料。微纳技术已成为解决组织工程中一些挑战性问题的潜在的强有力工具,既为准确控制细胞微结构和微环境提供了可能性,也为研究细胞与细胞、细胞与ECM之间的力学、电生理作用提供了技术平台,对于阐明疾病的发病/致病机理十分重要。更重要的是,在生物材料设计中化学和/或物理梯度的直接合并有利于构建不均匀的组织和组织界面。而进一步深入研究梯度力学刺激与细胞的关系,将有助于我们了解力学微环境在某些疾病的发病机理和创伤修复过程中的作用,有助于针对这些机理、过程采取新的更有效的应对策略,这在组织工程、基因治疗和提高创伤修复质量中具有重要意义。细胞微环境的动态变化对干细胞的生长也有重大影响,设计具有动态控制功能的水凝胶材料并将其用于揭示干细胞微环境的时空变化,将使干细胞在生物医学领域的应用发挥更大的潜力[41]。