红细胞衰亡及其在肝脏中的识别与清除机制

徐 薇,彭 芳,李 宁*

(中南大学湘雅医院a.输血科;b.卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,中国湖南长沙410008)

红细胞是血液中数量最多的一种血细胞,除了携带氧气之外,同时还具备免疫和凝血等功能。正常人体内的红细胞寿命平均为120 d,主要因逐渐衰老而死亡。体内外各种理化因素的刺激都可影响红细胞正常存活,导致其发生非衰老性死亡。当红细胞受到氧化应激、渗透冲击、能量消耗、神经酰胺、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、血小板激活因子(platelet-activating factor,PAF)等损害时,其形态结构及生理功能都会发生改变。为了保持红细胞完整性,避免由于细胞内血红蛋白释放而引起炎症反应,机体可能会触发红细胞自杀性死亡——红细胞衰亡(eryptosis)。近年来研究发现红细胞衰亡非随机事件,而是受到程序性死亡过程的调控,出现类似有核细胞的凋亡现象,表现为膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外翻、细胞皱缩体积变小以及细胞膜囊泡化等,这些衰亡的红细胞可被巨噬细胞表面的PS受体识别,进而被吞噬并降解[1]。肝脏是衰亡红细胞清除和铁代谢的主要器官,研究发现肝脏疾病中红细胞会出现不同程度的衰亡,而衰亡红细胞同时会通过增加肝脏铁负荷、促凝、促炎等病理生理作用促进肝损伤[2～5]。本文就红细胞衰亡及其在肝脏中的识别与清除机制予以简要综述。

1 红细胞衰亡的主要特征

1.1 细胞膜磷脂对称性破坏

红细胞膜的磷脂双分子层呈不对称性分布,PS通常仅位于细胞膜的内层,具有净负电荷,在维持红细胞正常功能中起着关键作用。膜内侧的PS除了可与血影蛋白交联维持红细胞形态及细胞膜可变形性,使得红细胞可穿过毛细血管及脾血窦,还可与血影蛋白末端残基结合使其免受糖基化,保持红细胞膜稳定性[6]。红细胞膜PS外翻暴露是一种衰亡信号,不仅可被巨噬细胞表面的PS受体识别,继而被吞噬清除,使机体出现溶血或贫血;还可通过改变膜电位,增强细胞膜阴性,增加红细胞与血管内皮之间黏附及血栓形成,在红细胞生命周期及病理生理调控中发挥重要作用[7]。

在各种损伤因素的刺激下,红细胞可通过活化混杂酶、抑制翻转酶等使PS外翻暴露于胞膜外,破坏胞膜的不对称性。研究表明,混杂酶(scramblase)的活性是影响胞膜PS外翻的主要因素,其与红细胞内Ca2+浓度密切相关[8]。当细胞内Ca2+浓度大于0.1 mmol/L时,混杂酶就会被激活,引起红细胞膜上PS外翻增多。腺苷三磷酸酶11C(ATP11C)为PS主要的内翻酶,当ATP11C基因发生突变时,会导致溶血性贫血[9]。除PS外,衰亡红细胞膜表面还会出现另一个巨噬细胞吞噬信号——带3蛋白的聚集[10]。Arashiki等[11]研究发现,带3蛋白簇在正常红细胞膜上的聚集率仅0.1%,而在高铁血红蛋白(MetHb)及氧化损伤共同作用下诱导的衰亡红细胞膜上可达60%,带3蛋白聚集常出现在红细胞衰亡晚期,为衰亡红细胞的重要特征之一。

1.2 囊泡释放

红细胞衰亡时以出芽的形式从细胞膜上释放直径 0.1～1 μm的双层磷脂囊泡(microparticles,MPs),这个过程被认为是一种对细胞应激的原始应答,也是红细胞摆脱特定的有害物质侵袭并维持稳态的一种方式。这些囊泡在传递细胞间信息、清除老化红细胞、储存损伤、血栓形成及免疫反应等过程中发挥重要作用,与镰刀型贫血、溶血性贫血及败血症等多种疾病有关[12]。红细胞囊泡的形成与细胞膜不对称性被破坏有关,当红细胞发生衰亡时,细胞膜上PS外翻增多,细胞骨架紊乱,同时蛋白质错位与交联,从而导致囊泡形成并释放。红细胞以在棘突尖端出泡的形式丢失细胞膜,释放的囊泡在内皮网状系统中被迅速清除。红细胞囊泡的形成主要有两种方式,其一为钙离子诱导囊泡形成,其二则与带3蛋白聚集有关[13]。

2 红细胞衰亡的主要机制

2.1 胞内Ca2+浓度上升

在正常生理状态下,红细胞膜对Ca2+通透性低,并可依靠膜两侧强大的钙泵将Ca2+主动排出,使得细胞内Ca2+浓度维持在0.1 mmol/L的较低浓度。红细胞膜上Ca2+通道是红细胞内Ca2+浓度上升的主要途径。Ca2+通道可在渗透性应激、能量缺乏、高温和低Cl-等生理病理条件或PGE2[14]、糖蛋白激素以及促红细胞生成素等生物介质刺激下激活。目前研究证明这种非选择性Ca2+通道的开放与红细胞膜上的瞬时受体电位通道6(transient receptor potential canonical 6,TRPC6)有关[15]。Ca2+依赖性磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)及环氧合酶(cyclooxygenase,COX)在红细胞衰亡中发挥重要作用。红细胞受到渗透休克或Cl-缺乏时,活化的PLA2和COX可引起PEG2生成和释放,并进一步激活TRPC6通道,引起Ca2+内流,导致细胞内Ca2+浓度上升及活性增加。Ca2+不仅可通过活化半胱氨酸内肽酶钙蛋白酶(cysteine endopeptidase calpain),降解细胞骨架蛋白,促使细胞膜囊泡化,而且可以刺激Ca2+敏感的K+通道活化,引起KCl外流和细胞膜的超极化,进而使细胞因渗透性失水而萎缩。更为重要的是,Ca2+浓度上升可活化胞膜混杂酶,使细胞膜内部的PS外翻暴露,磷脂成分不对称破坏,进而引发膜结构紊乱,促使红细胞进入衰亡程序[16]。

当能量供给不足引发红细胞衰亡时,蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)发生转位激活,催化红细胞表面膜蛋白磷酸化,进而导致PS外翻暴露于细胞表面,同时诱发细胞收缩并进一步加强Ca2+内流。此外,活化的PKC可直接激活Ca2+电压门控通道的一种亚型Cav2.1通道,促进Ca2+内流进入红细胞[17]。研究发现,AMP依赖的蛋白激酶α (AMP-activated protein kinase α,AMPKα)作为红细胞内一种能量感应酶,其在葡萄糖剥夺的能量缺乏环境下,一方面通过抑制红细胞膜上PS外翻,使得红细胞免受巨噬细胞吞噬,另一方面通过抑制胞内Ca2+浓度上升,从而抑制红细胞衰亡的发生[18]。

2.2 氧化应激损伤

氧化应激为红细胞损伤的主要因素。红细胞内虽然存在谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等强大的抗氧化防御系统,但由于红细胞内含有可催化脂质过氧化的血红蛋白,红细胞膜上富含易受活性氧(reactive oxygen species,ROS)攻击的多价不饱和脂肪酸,因而红细胞极易发生氧化应激损伤。氧化应激损伤或抗氧化防御缺陷会诱发红细胞衰亡,研究表明氧化应激不仅可通过激活Ca2+通道增加红细胞Ca2+内流,也可激活caspase凋亡蛋白酶[19],进而裂解阴离子交换体带3蛋白,降解膜蛋白,破坏细胞骨架。同时,活化的caspase可通过抑制氨基转移酶和PS翻转酶活性,刺激PS外翻暴露,从而引发红细胞衰亡[20]。

2.3 神经酰胺刺激

神经酰胺为红细胞衰亡的重要刺激因子,可在发热、败血症、溶血性贫血、溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)、终末期肾脏疾病、肝衰竭及Wilson等多种疾病中激活红细胞衰亡程序。在渗透冲击、氧化应激等因素刺激下,红细胞合成释放的血小板激活因子增加,并激活神经磷脂酶合成神经酰胺。在神经酰胺的作用下,红细胞对Ca2+高度敏感,红细胞内Ca2+浓度增加可激活PS外翻,抑制红细胞膜与细胞骨架蛋白的交联,引发膜结构紊乱,从而促进红细胞衰亡[21]。同时,神经酰胺可通过直接激活胞内翻转酶,进一步催化PS翻转暴露于细胞外,这一非Ca2+依赖型的信号通路机制,对胞质Ca2+浓度增加引发的红细胞衰亡起到协同效应。此外,PAF还可进一步激活Ca2+敏感的K+通道,增加红细胞膜上Gardos通道对Ca2+的敏感性,激活钙蛋白酶,从而降解细胞骨架[22]。

3 衰亡红细胞对肝脏的病理生理影响

3.1 肝脏枯否细胞对衰亡红细胞的识别与清除

Lee等[23]发现肝窦内皮细胞通过stabilin-1及stabilin-2以PS依赖性方式分选衰亡红细胞。不论肝脏枯否细胞存在与否,肝窦内皮细胞均能分选出衰亡红细胞或PS包被的红细胞囊泡。研究认为,肝脏枯否细胞识别红细胞主要包括以下路径:1)巨噬细胞表面Fcγ受体识别红细胞膜上IgG抗体Fc区域[24];2)补体受体识别补体C3复合物[25];3)巨噬细胞表面抗带3蛋白抗体与衰亡红细胞增多的带3蛋白结合[26];4)巨噬细胞细胞膜上的stabilin-2、BAI1、Tim-1、Tim-4、CD300 直接识别衰亡红细胞膜表面PS[27]。此外,络氨酸激酶受体、整合素αvβ3和αvβ5可通过PS连接分子识别衰亡红细胞膜上的PS[8]。研究表明,PS介导的巨噬细胞噬红细胞作用虽不是清除衰老红细胞的主要途径,但却是清除衰亡红细胞的主要途径[28]。红细胞膜上存在着抑制噬红作用的分子,其中最主要的分子为CD47。红细胞膜上的CD47分子可与巨噬细胞膜上的SIRPα交联,CD47-SIRPα交联分子可抑制巨噬细胞对红细胞的吞噬作用。红细胞衰亡时细胞膜表面CD47分子减少,巨噬细胞对红细胞的吞噬作用增强[28]。

已有研究表明,小鼠红细胞衰亡过程中,约20%血红蛋白随着红细胞衰亡所释放的MPs丢失,近92%红细胞囊泡被肝脏枯否细胞吞噬而清除。红细胞在衰亡过程中会释放含有血红蛋白的MPs,导致平均红细胞体积、平均血红蛋白含量以及平均血红蛋白浓度均降低。人衰亡红细胞所释放的MPs与小鼠衰亡红细胞释放的MPs的清除方式相似[29]。

3.2 肝脏清除衰亡红细胞后的铁代谢

肝脏是铁回收利用的主要器官,同时也是调控铁离子、氧化作用和促红细胞生成素的中心器官。衰亡红细胞在肝脏中经过枯否细胞的噬红细胞作用后,其中的血红蛋白经代谢降解产生铁离子,未与蛋白质结合的离子铁无法参与胞内铁代谢。在生理情况下,铁离子主要存在于3种化合物中,即铁蛋白、转铁蛋白、血红蛋白。枯否细胞中的铁离子通过天然抗性相关巨噬细胞蛋白1(natural resistance-associated macrophage protein 1,Nramp1)[30]运送至枯否细胞外,运输至细胞外的铁离子主要储存在铁蛋白上,在机体需要时通过转铁蛋白释放入血液循环中。肝细胞通过精细调节铁调素(hepcidin)防止铁过载[31]。

非铁蛋白结合铁(non-transferrinboundiron,NTBI)主要是指在转铁蛋白饱和时所出现的结合铁的形式。NTBI是一种潜在的有毒铁形式,因为其具有诱导活性氧的倾向,所以不仅会对细胞膜造成损伤,而且也会对细胞器造成损害。在HFE、HJV和TfR2等基因相关的遗传性铁过载紊乱疾病以及铁调素缺乏的肝损伤疾病中,胞内过多的铁主要以NTBI的形式存在[32]。

3.3 衰亡红细胞对肝脏疾病的病理生理影响

近年来研究发现,衰亡红细胞主要是在肝脏被清除,在这里它们的铁原子得以保存下来供给新细胞使用。血液中的衰亡红细胞可导致骨髓源性单核细胞迅速增加,这些单核细胞摄取衰亡红细胞后被趋化因子吸引并定居在肝脏处,转化成能回收铁的过渡巨噬细胞[2]。越来越多研究表明,衰亡红细胞与肝脏疾病密切相关。Lang等[3]发现结扎小鼠胆管后,小鼠血清胆红素浓度迅速上升,在3周内红细胞数量、红细胞比容迅速下降;经过进一步研究,他们发现高浓度胆红素可通过促进Ca2+内流及神经酰胺形成引起红细胞衰亡。此外,他们也证实了在伴有血清胆红素浓度升高的肝脏疾病患者中,红细胞发生了衰亡,衰亡红细胞进一步促进血清胆红素升高,造成恶性循环。

在Xia等[4]的研究中,他们发现小鼠输注库存14 d的库存血后,肝脏中丙二醛含量增多,过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性增强,同时肝脏中肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)浓度升高。Wu等[33]探索了库存较久红细胞对败血症肝损伤的影响。他们建立了由铜绿假单胞菌所致的败血症小鼠模型,将库存红细胞输入小鼠体内,发现输注了库存红细胞的小鼠体内促炎因子生成增多并导致肝损伤,这些促炎因子主要包括TNF-α、IL-6、IL-1β,主要由活化的M1极化枯否细胞产生。M1极化枯否细胞及其所分泌的促炎因子可通过促进促凋亡蛋白JNK活化及抑制抗凋亡蛋白NF-κB活性使肝细胞发生凋亡[34]。

PS外翻使电中性的红细胞膜呈负电荷,呈负电荷的磷脂膜及钙离子可促进凝血酶复合体的形成,进而活化凝血因子X,激活内源性凝血途径及外源性凝血途径,促进血栓形成[5]。循环系统中的MPs表面携带有组织因子,被称为血源性组织因子(blood-borne tissue factor)。血源性组织因子在促进血小板聚集形成血栓中起着重要作用[35]。大量红细胞衰亡后,肝细胞内积累的铁离子可通过Haber-Weiss反应促进ROS生成,ROS进而促进脂质发生过氧化反应。已有研究表明,铁离子诱导的过氧化反应可损害大鼠干细胞的溶酶体膜、线粒体和细胞核等不同的亚细胞结构[27]。此外,在肝细胞水平,NTBI可通过促进铁进入细胞内及抑制胆道释放铁两种方式增加细胞内铁含量,发挥细胞毒性作用[36]。

4 结语

红细胞衰亡是指成熟红细胞在各种因素刺激下发生的自杀性程序性死亡,红细胞衰亡的主要机制包括成熟红细胞胞内Ca2+浓度升高、胞内活性氧累积、神经酰胺形成,主要特点为红细胞膜磷脂对称性被破坏及释放囊泡。肝脏为清除衰亡红细胞的主要器官[33],衰亡红细胞在肝脏疾病中也有着重要的病理生理意义,衰亡红细胞的铁代谢产物对肝脏细胞产生细胞毒性,所释放的囊泡可通过促凝、促炎等方式使肝细胞发生凋亡。自Lang等提出红细胞衰亡以来,随着研究深入,红细胞衰亡的主要特征、主要调节机制等方面已取得较大的进展,但如何在清除衰亡红细胞时不引发自身免疫反应及其如何激活及调节免疫系统尚有待更深入的研究[7]。同种病理条件下的红细胞可发生不同的死亡方式,例如镰刀型红细胞不仅可发生红细胞衰亡被巨噬细胞清除,也可发生血管内溶血后直接释放血红蛋白[37],这说明红细胞衰亡与红细胞溶血之间可能存在关联,但二者之间的关联尚未见研究。此外,受伦理及实验条件的限制,红细胞体内研究多在动物身上进行,不可忽视的是人红细胞与小鼠红细胞存在许多不同,如造血器官、红细胞寿命、红细胞膜蛋白质等均有差异。例如:ATP11C作为脂类的翻转酶,在新陈代谢和机体免疫等多种生命活动中起重要作用。ATP11C基因突变患者仅有溶血性贫血的相关临床症状,不伴有其他临床症状,而ATP11C基因突变小鼠会出现口形细胞增多症、B细胞缺乏症、胆汁淤积以及肝肿瘤等疾病,这表明在小鼠及人体中,ATP11C有着不同的生物学功能[38]。将小鼠红细胞所获得的结论应用于人红细胞时,仍需要进一步阐明。总之,深入研究红细胞衰亡及其在肝脏中的识别与清除机制,有助于明确红细胞衰亡在肝脏疾病中的作用及病理生理学意义。