基于功能化纳米复合材料的新型辣根过氧化物酶生物传感器的研究技术

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(河南大学 生命科学学院，河南 开封 475000)

生物传感器诞生于上世纪六十年代，经过50多年的不断改进和发展，各种新型材料、技术手段逐渐被引入生物传感器的研究，给生物传感器领域增添了新的生机与活力。在生物传感器中，酶生物传感器的出现打破了传统的做法和思维，成为生物传感领域的一大热门研究方向。研究者尝试将各种新型材料引入生物传感领域，尤其是纳米材料的发展，将生物传感器的研究带入了一个新阶段。生物传感器中最常用的是酶电极，酶电极制备的关键就是如何在保持酶活性的同时将酶固定在电极上。然后用各种方法对其机制进行研究。

1 不同材料在辣根过氧化物酶传感器中的应用研究

许淑霞,吴金生等[1]针对用纯物理方法固定酶易使其脱落的问题，为解决这一问题，他们将纳米金与HRP混合物再固定在多壁碳纳米管(MWNTs)修饰的Pt电极上，且碳纳米管、纳米金对电流有放大作用，大大提高了传感器的灵敏度和稳定性，具有更高的应用价值。

祝敬妥，张卉等[2]将壳聚糖和无掺杂的金刚石纳米粒子(UND)电沉积到玻碳电极表面，再进一步固定上HRP。又用SEM表征、电化学交流阻抗、循环伏安等技术来研究复合膜及HRP生物活性。即此复合膜实现了HRP和电极之间的直接电子传递，可用于研制更灵敏的过氧化氢传感器。

冯亚娟，魏玉萍等[3]经Hummer法等自主合成了氧化石墨烯(GO)，并将其与纳米金颗粒、壳聚糖(CHIT)及HRP混合修饰到玻碳电极上，制得H2O2传感器。通过检测pH值、工作电位的影响优化实验条件，很好地增长了传感器的使用寿命。

接德丽 ，徐欢等[4]利用既环保又有良好的生物相容性肌醇六磷酸钙(Ca-IP6)与HRP共同制得Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE传感器。检测发现，该电极对过氧化氢，响应迅速、稳定性好。

姚慧，李小红等[5]用室温离子液体作粘合剂，在石墨中加入一定量的碳纳米管制成新型碳糊电极后，用于H2O2的检测。检测结果表明，这种新型碳糊电极对过氧化氢响应迅速，电催化活性高，更有利于电子的有效传递，同时良好的稳定性和选择性使其在实时检测中具有更广阔的应用前景。

2 各种电化学方法用于实验结果的分析讨论

电化学分析根据测量方法能分为许多种，其中循环伏安法(CV)是最为常用的一种研究方法，其可对电极上的电活性物进行定性、定量分析，以得到电极反应过程的电子转移数、电子传递速率、热力学可逆性和各种动力学参数等，从而能进一步了解电极反应的机制机理。

2.1 表征

潘羽侠等[7]利用微波合成法合成植酸钛纳米材料，并与辣根过氧化物酶共修饰到玻碳电极表面，又用场发射扫描电子显微镜(FESEM)分别表征了植酸钛与HRP混合前后的形貌变化，来说明HRP已经很好地修饰到植酸钛上，这种结构也有助于实现直接电子传递。

焦守峰等[8]合成了金纳米粒子修饰的PDA球，对其进行详细的表征，SEM图上可观察到PDA纳米球上均匀地修饰上了AuNPs，更进一步确定了其形貌和组成。

2.2 修饰电极的直接电化学行为

陈绪胄，李建平[9]用不同电极在磷酸盐缓冲溶液中于0.1～-0.6V间进行循环伏安扫描，结果显示，HRP/Ag/Cys/GCE 电极有一对氧化还原峰，并且 HRP在Ag/Cys/GCE电极表面能进行稳定、有效的直接电子转移。根据 HRP/Ag/Cys/GCE电极在 0.067 mol/L PBS(pH值7.0)中不同扫描速度下的循环伏安曲线，可做出氧化还原峰值电流大小与扫速的平方根呈线性关系，来表明该电极表面扩散的机制。

焦守峰等[8]研究了不同电极的电化学行为，发现AuNPs对HRP 的直接电化学过程至关重要。Nafion/HRP-Au/PDA/GC 电极的CV 图上分别在-347 mV 和-378 mV 给出了HRP的氧化峰和还原峰，对应于HRP-Fe(III)/HRP-Fe(II) 电对的单电子氧化-还原过程。由于PDA表面对蛋白质的强吸附作用，HRP 的式量电位更接近其氧化还原标准式量电位。且随着H2O2的加入，HRP 的氧化峰电流逐渐减小，还原峰电流线性增加。基于此，可采用计时电流法，有望在0.10～0.30 μmol/L范围内用于实际样品中生物反应产生的H2O2的检测。

2.3 检测条件的优化

2.3.1 修饰电极对H2O2的催化响应

姚慧等[5]用制成的新型碳糊酶电极(HRP/MWCNTs/CILE)，在适合的磷酸缓冲溶液中对H2O2检测，发现还原峰和氧化峰强度均增大，这说明HRP对于H2O2的还原有明显的催化作用。

高海燕等[11]用聚氨酯丙烯酸酯预聚体和辣根过氧化物酶混合修饰在玻碳电极表面，通过光固定法制备得到HRP-PUA/GC电极。检测HRP-PUA/GC电极对H2O2的催化活性时发现，氧化峰和还原峰峰值电流均有明显的变化。

2.3.2 pH值的影响

王超凡等[12]用乙二胺将酪氨酸酶(Tyr)固定在功能化GO修饰的玻碳电极(GCE)上。然后用不同pH值检测对HQ影响时发现，pH值6.5时氧化峰值电流达到最大；这与该酶pH值的相近，酶的活性未被改变，因此选择pH值6.5作为该体系测试的pH值。

赵红叶等[13]基于SiO2和Fe3O4纳米粒子构置出Hb-Fe3O4-SiO2-Chit/ITO电极，研究了血红蛋白在该电极上的电子传递的机制，并考察了溶液pH值对Hb-Fe3O4-SiO2-Chit/ITO中Hb的循环伏安行为的影响，发现E0'与pH值的斜率为-48.3 mV·pH值-1，这与一电子一质子反应的理论值(-59.0mV·pH值-1)接近。当溶液pH值=7.0时，Hb的响应最大，因此实验选择pH值7.0的PBS作支持电解质。

2.3.3 工作电位的影响

冯亚娟，魏玉萍等[3]将合成的氧化石墨烯与纳米金颗粒、壳聚糖、辣根过氧化酶混合修饰到玻碳电极上，然后进行条件优化，在测试工作电位时，发现在-0.10 V作为工作电位时可以避免一些干扰物在负电位下的还原。

黄锐[14]在新型碳纳米材料的酶及生物碱电化学传感技术研究中，用全修饰的新电极，在优化检测电位时发现，当工作电位从-0.4V上升到-0.25V，响应电流逐渐增大；-0.25V上升到-0.1V时，还原电流又呈现减小的趋势。在过负的电位下，一些物质容易发生还原反应而产生干扰。故实验选择-0.25V作为检测电位。

2.4 稳定性和重现性

高海燕等[11]将HRP-PUA/GC电极在合适的PBS中连续循环扫描，结果发现，除最开始的1圈峰形有异常外，之后的峰电流仍然几乎不变，表明HRP在电极表面的直接电子转移随连续扫描次数的增加是相当稳定的。然后又将全修饰电极保存在相应的PBS中一个月，其伏安响应几乎无明显变化，进一步表明该电极有极高的稳定性。

郭小玉，苗云等[15]将修饰好的Nafion/HRP-IP6 micelles-GNPs/GCE电极进行稳定性测试。先在PBS中以100 mV/s 连续扫描50圈，其响应电流无变化。Nafion/HRP-IP6 micelles-GNPs/GCE 传感器放置在4℃下储存30d后，测定其循环伏安电流及峰位置是否发生变化，且得到的响应电流为初始电流的94%。因此，全修饰电极有很好的稳定性。

2.5 抗干扰性测试

王超凡等[12]用乙二胺将Tyr共价修饰到功能化GO上。然后对该电极进行一些干扰物质的检测，其误差控制在±5%以内，对0.2 mmol/L HQ溶液进行测定。结果显示，大多离子和酚类的有机物对HQ的测定不会造成干扰。

马丽萍等[16]将HRP直接固定在电聚合ZrO2修饰的金电极表面制得了新型HRP酶生物传感器。在含有0.15 mmol/L H2O2的PBS中，分别加入0.30 mmol/L的5种干扰物质，测定它们对该传感器响应信号的干扰情况。实验结果表明，这些物质基本不会影响H2O2的测定。

3 展望

随着各种新型材料的问世，酶的直接电化学已进入到一个新的发展阶段。越来越多的科研工作者尝试使用纳米金、富勒烯、纳米二氧化钛、离子液体等多种材料与酶结合，构建出许多新型的生物传感器，大大拓宽了其应用范围，在科学研究、疾病诊断、食品检测、环境监测等领域具有重要作用。本文着重总结了近年来酶生物传感器领域的一些研究成果，并列举出一些实验结果的电化学分析方法，希望对生物传感器的研究原理和过程有更清晰的认识，更期望通过学习前人的大量实验成果，寻找到生物传感器领域的新突破。

致谢: 感谢河南大学生命科学学院对本项目以及参加全国大学生生命科学联赛的大力支持。