生孢噬纤维菌研究进展

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(发酵工程教育部重点实验室(湖北工业大学) 工业微生物湖北省重点实验室工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068)

目前，全球绝大部分的民用及工业能源消耗都是来自于石油、煤炭等化石燃料，随着这些不可再生资源的日渐匮乏，发现新的替代能源成为时代的主题。天然纤维素是植物利用光能，通过光合作用生产的一类天然资源[1-2]。天然的纤维素分子化学性质稳定，不溶于水，也不溶于有机溶剂。纤维素分子由许多β-G葡萄糖残基组成，通过β-1,4糖苷键联结起来[3]，由于连接在环上碳原子两端的OH和H位置不相同，所以具有不同的性质。在天然纤维素中，聚合度可达10000左右；再生纤维素的聚合度通常为200～800。在一个样品中，各个高分子的聚合度可以不同，具有多分散性。从上世纪40年代至今发现的能降解纤维素的微生物，既有好氧性微生物也有厌氧性微生物，既有细菌也有真菌。这些纤维素降解微生物中，霉菌具有较高的纤维素酶活而被广泛研究利用，虽然细菌降解纤维素效率很高，但几乎检测不到相应的酶活力，这成为纤维素降解领域的一个未解问题。

生孢噬纤维菌是纤维素降解细菌中极具特色的一类生物群体，研究发现该类细菌能够迅速降解滤纸纤维素、微晶纤维素粉等，并生产多糖等生物活性物质。生孢噬纤维菌区别于霉菌降解纤维素的方式引起了科学家的广泛关注，阐明生孢噬纤维菌降解纤维素的分子机制对天然纤维素资源化利用具有重大的意义。生孢噬纤维菌对天然纤维素的生物降解不仅可以为生物质能源的利用提供一个途径，且可以利用其生长代谢过程中生产多糖等物质为生产实践应用奠定基础。同时，生孢噬纤维菌的研究也为发展细菌降解纤维素领域的研究提供一个范例。

1 厌氧纤维素降解微生物

1.1 厌氧性纤维素降解真菌

在反刍动物中的瘤胃中存在一定数量的厌氧真菌，厌氧真菌生产大量的高活性纤维素酶降解植物的木质化组织。瘤胃中的主要优势菌属于真菌界Neocallimastigales目的真菌[14]，该类菌群在木质纤维素的降解中起着重要作用。与其他瘤胃微生物相比，瘤胃厌氧真菌不仅能分泌比较全的降解天然木质纤维素酶系，而且能降解晶体状的、结构复杂的纤维素[4]。除了瘤胃细菌外，厌氧的真菌也可以参与纤维素的降解。1977年，Orpin首次证明厌氧真菌具有降解植物细胞壁的能力[5-6]，之后大量实验证明：厌氧真菌是食草动物消化道内降解木质纤维素最有效的微生物类群[7]。

1.2 厌氧性纤维素降解细菌

天然存在的能降解纤维素的厌氧细菌以高温菌最为典型，它们在高温厌氧的条件下具有很强的纤维素降解能力，其产生纤维素酶具有极强的热稳定性。上世纪50年代，G. Halliwell等采用滚瓶法获得了厌氧菌的纯培养[8]，基于此方法热纤梭菌等多株厌氧细菌被分离纯化出来[9-13]，针对这些厌氧细菌的生理学和生物化学特性进行了大量的研究。降解纤维素的厌氧细菌包括一些革兰阴性细菌和全部革兰阳性细菌。革兰阳性细菌包括梭状芽孢杆菌属、厌氧纤维菌属(Anaerocellum)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、真杆菌属(Eubacterium)，还有部分的螺旋体(Spirochaeta)也有降解纤维素的能力，例如嗜热螺旋体(S.thermophila)。革兰阴性细菌包括热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、醋弧菌属(Anaerocellum)、丝状杆菌属(Fibrobacter)、闪烁杆菌属(Feridobacterium)、嗜盐菌属(Halocella)和栖热袍菌属(Thermotoga)[14]。

2 好氧性纤维素降解微生物

2.1 好氧性纤维素分解真菌

真菌被认为是自然界中有机物质的降解生物，它对纤维素的降解能力尤为突出。许多真菌都具有很强的纤维素分解能力。在潮湿土壤中，真菌是纤维素分解的优势菌群。真菌类有黑曲霉、卧孔属、血红栓菌、绳状青霉、疣孢漆斑菌 QM460、变幻青霉、乳齿耙菌、变色多空霉、腐皮镰孢、康氏木霉、绿色木霉、里氏木霉、嗜热毛壳菌 QM9381 和嗜热子囊菌 QM9383等[15]。其中研究较多的是木霉属，因其高产量的纤维素酶而被广泛应用。

2.2 好氧性纤维素分解放线菌

放线菌分解纤维素的能力较弱，但在不利条件下放线菌比其他微生物更能耐受高温和各种酸碱环境。高温放线菌可以从自然界中许多地方分离出来,如沙子、成熟堆肥、马粪和果园土中。主要包括诺卡氏菌属(Nocardia)、节杆菌(Arthrobucter)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、小单孢菌属(Micromonspora)和链霉菌属(Streptomyces)等。从堆肥中分离出来的多种嗜热单孢菌，具有分解木质素材料中纤维素的能力[16-22]。吴翔[23]等人从高温稻草堆肥中分离到1株能降解纤维素的放线菌CN 9,研究发现菌株CN 9在培养第3天就产生丰富的基内菌丝,并且不断裂,随后在基内菌丝上逐渐形成大量的长直孢子链。且该菌株生长温度和生长所需pH均较广。刘东波、高培基、王祖农教授等于 1990 年通过吉林长白山黑土地中分离到一株同时具有降解纤维素和固氮能力的诺卡氏放线菌[24]。

2.3 好氧性纤维素分解细菌

在自然界中分布的纤维素降解细菌主要包括纤维弧菌属(Cellvibrio)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)和噬纤维菌属(Cytophaga)等[9]。这些细菌大多数是能够进行活泼运动的中温好氧菌，其对天然的纤维素的分解能力一般较弱。20 世纪 50～60 年代，山东大学王祖农教授对好氧性纤维素细菌的分离纯化方法作了改进，并且得到了嗜盐性菌株[25]。

纤维素降解细菌中很有特色的生孢噬纤维菌因为在纤维素底物上可以很快滑动，因此，为分离纯化带来了极大困难，国内山东大学的法明、高培基等人通过改进实验方法，采用双层平板法提高了培养基的选择性，并且从土壤中分离筛选到了一株好氧性降解纤维素的生孢噬纤维菌[2]，由于生孢噬纤维菌分离纯化非常困难，到目前为止，国内外也只有很少几个实验室拥有生孢噬纤维菌菌种。

3 生孢噬纤维菌

3.1 生孢噬纤维菌降解特点

生孢噬纤维菌是土壤中常见的好氧性纤维素分解细菌，其对纤维素的分解能力极其强大，且对纤维素有不同程度的专一性。它在滤纸上生长时，滤纸表面会出现肉眼可见的淡黄色的菌落，并有黏液，并且在长有菌落处的滤纸已经溶解变薄，最重要的是其分解所需要的时间极短。生孢噬纤维细菌是非常有特色的好氧性降解纤维素细菌，它属于能够降解纤维素的滑动细菌，能够在固体纤维素表面快速滑动，电子显微镜研究表明，滑动和产生粘液的细菌与纤维素原纤维紧密接触，其主轴平行于微纤维[26]。生孢噬纤维菌依靠滑动，能够吸附到赖以生长的不溶性固体介质表面获取营养，同时产生大量胞外多糖，这种特性对于降解不溶性纤维素有着非常重要的作用[1]。

3.2 生孢噬纤维菌生产多糖

微生物多糖主要是由细菌、真菌和蓝藻类产生，由于各种菌生长的环境不同，其遗传及生理特性与其他生物相比也大不相同，因此也产生了具有独特功能的活性多糖，通过对各种细菌的大量研究，人们发现了多种具有不同特性的细菌多糖，分别具有抗肿瘤、增强免疫作用、抗病毒、抗细菌、抗辐射等生物学活性。生孢噬纤维菌作为一类具有较强纤维素降解能力的好氧性滑动细菌，同时产生大量的胞外多糖。Coughln[27]等人在进行Sporocytophaga的生理生态,分离鉴定等工作时,同时指出该菌株产生的多糖具有免疫增强活性等多种生物学功能，可用于开发免疫增强剂和其他多糖类药物。

3.3 生孢噬纤维菌生产纤维素酶

纤维素酶是广泛存在于自然界生物体中一类纤维素降解酶。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶，而在工业生产上应用广泛的是来自子囊菌的丝状真菌类群[28]。刘金胜[29]等人曾经用几种农药对厌氧纤维分解菌降解纤维素的活性进行测定，结果发现除草剂卞嘧磺隆和丁草胺对纤维分解菌的活性影响均不大,甚至对纤维素降解菌的分解活力具有少量的促进作用。而杀虫剂三唑磷在浓度为0.8 mg/L以上时,对纤维分解菌具有明显的抑制作用。王秀然等于2012年使用葡聚糖凝胶过滤、DEAE离子交换技术，通过生孢噬纤维菌Sporocytophagasp. JL-01纯化了纤维素酶组分FPase1，该FPase1纤维素组分具有55 kDa分子量，50℃时表现出最佳滤纸酶活[30]。1975年，Kristian[31]等从生孢噬纤维菌Sporocytophagamyxococcoides的培养上清液中分离出两种具有低含量碳水化合物、氨基酸组成非常相似，且表现出羧甲基纤维素酶活的细胞外纤维素酶。Kristian等通过研究鉴定了这两种纤维素酶成分 ,获知两种纤维素酶都是作为内切葡聚糖酶而发挥活性。

3.4 生孢噬纤维菌分子水平研究

国内外专家普遍认为，基因组序列图在分子层面上取得的突破，推动了生命与医学科学的革命性进展。Sporocytophagamyxococcoides是一种从土壤中分离出的有效的降解纤维素的生孢噬纤维菌。2014年，Liu L 等测定了其基因组序列草图，并得出有助于该细菌的纤维素降解能力的纤维素分解酶以及半纤维素分解酶的重要遗传信息[32]。刘建[33]等人通过在SDS加热裂解法的基础上，再进行了30s的沸水浴处理从而获得了纯度高、完整性好的基因组DNA，并利用其进行了纤维素酶表达的初步试验，在研究中发现纤维素酶能够被分泌到胞外，并且具有一定的活力，这为生孢噬纤维菌纤维素酶的进一步研究奠定了基础。

4 结论与展望

纤维素的生物降解现象早在 1886 年就被发现，但直到 1950 年之后才有纤维素酶相关的比较系统性文章报道。这些天然纤维素降解的报道多集中于真菌纤维素降解的报道。目前，国内外对生孢噬纤维菌的报道甚少，通过研究发现，生孢噬纤维菌具有极强的纤维素降解能力，但对其纤维素降解机制却知之甚少，特别是几乎检测不到纤维素酶活[1]。关于其对纤维素的降解机制及纤维素酶的特性研究还需要进一步完善

关于生孢噬纤维菌胞外多糖的研究还有很大的提升空间，迄今为止，国外仅有Coughln[27]等人在对有关 Sporocytophaga 的生理生态,分离鉴定等做阐述的同时，指出该菌株产生的多糖具有免疫增强活性等多种生物学功能，可用于开发免疫增强剂和其他多糖类药物。国内有王浩[34]等人于1996年对生孢噬纤维菌胞外多糖的研究，发现其产生的胞外多糖有一定的抗盐性，适应酸碱的能力，以及耐受高温。但其发酵周期太长，且产率太低。

目前，生孢噬纤维菌的研究进展极其缓慢，存在着很大不足，如需要发现新的筛选菌种的手段，发现其独具特色的纤维素酶，进行比较基因组学、比较转录组学领域的研究。在未来科技手段进步的条件下，相信这些研究瓶颈都会得到解决。利用生孢噬纤维菌降解纤维素不仅可以减少资源的浪费，且在食品、环保、保健品等行业利用具有一定促进作用。生孢噬纤维菌纤维素降解机制的阐明及其代谢产物的生产定会为天然纤维素的利用提供新的思路。