载体介导的布鲁菌外膜蛋白疫苗研制现状

李文桂,陈雅棠

重庆医科大学附属第一医院 传染病寄生虫病研究所，重庆400016

布鲁菌（Brucella）引起的布鲁菌病是严重危害人畜健康的传染性疾病，常引起感染家禽的流产或不孕，还能引起感染人群的波状热、心内膜炎、关节炎或骨髓炎。常见的致病菌种为羊种马耳他布鲁菌（B.meliteasis）、牛种流产布鲁菌（B.abortus）、猪种布鲁菌（B.suis）、绵羊附睾种布鲁菌（B.ovis）、犬种布鲁菌（B.canis）和沙林鼠种布鲁菌（B.neotomae）。布鲁菌病常用灭活疫苗、减毒活疫苗、突变株疫苗、亚单位疫苗和DNA 疫苗等进行免疫预防[1-4]。常见的灭活疫苗种类有牛种布鲁菌45/20 株、19-B 株 和104M 株 以及 羊种H38 株等，这类疫苗接种剂量大，但诱导的保护力差。减毒活疫苗的种类有羊种Rev-1 株、M5 株和RB51 株，牛种S19 株以及猪种S2 株，它们均可诱导较好的保护力，但毒力不稳，毒性较大，返祖现象严重，常对免疫的人和动物造成伤害，且很难区分是自然感染或是人工接种免疫，从而干扰常规的血清学诊断。基因突变株疫苗尽管可诱导较好的保护力，但存在毒力返强的可能性；亚单位疫苗的免疫剂量大，成本高，免疫效果不稳定；DNA 疫苗在动物体内表达量较低或出现基因沉默不表达的情况。因此，需要进一步研制新型疫苗。外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）是布鲁菌的脂蛋白，与该菌的毒力密切相关。其中，OMP16 可作为一个新的细菌病原体相关分子模式，在TLR4-MyD88 信号传导通路中具有重要作用，可激活细胞内的树突状细胞，引起Th1 应答，可作为佐剂使用；OMP22 属于OMP25/OMP31家族，具有高度保守性，可分泌表达于细菌表面，是一种毒力因子，与布鲁菌的侵袭和毒力有关，可引起Th1 免疫应答；OMP25 的保守性较高，与布鲁菌的毒力有关；OMP28 又称Bp26，是一种由细胞内向外释放的可溶性周浆蛋白，具有较强的免疫原性；OMP31 是一种有效的免疫原。将这些外膜蛋白的DNA 疫苗或重组蛋白免疫小鼠均可有效对抗布鲁菌有毒株的攻击感染[5-14]，上述资料表明外膜蛋白可作为有前景的候选抗原分子。

人们发现鼠伤寒沙门菌、卡介苗、根癌农杆菌、大肠杆菌、毕赤酵母、禽流感病毒、山羊痘病毒和牛痘病毒等病原体的减毒株经过改造可作为载体使用。本文简要综述以细菌和病毒载体为传递载体的布鲁菌OMP 疫苗的研制现状。

1 以细菌为载体的布鲁菌OMP 菌苗

1.1 鼠伤寒沙门菌作为载体

布鲁菌细胞表面蛋白31（Brucellacell surface protein 31，BCSP31）是一种毒力因子，与该菌的胞内生存和繁殖相关；脯氨酸消旋酶亚单位A（proline racemase subunit A，PrpA）具有较好的免疫原性；Cu/Zn 过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）位于该菌的胞膜和胞质中，可影响吞噬细胞对布鲁菌的杀灭作用。将BCSP31、PrpA或SOD 的DNA 疫苗或重组蛋白质肌肉注射C57BL/6 鼠，可产生有效的免疫应答[15-18]。

Kim 等[19-20]以布鲁菌544 株的基因组DNA 为模板扩增BCSP31、OMP22、PrpA 和SOD 基因，分别插入pET28α，与pMMP65 重组得pMMP-BCSP31/OMP22/PrpA/SOD，分别电穿孔转化鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium，St）JOL912 株，筛选阳性重组菌；免疫印迹提示布病患者的血清可结合重组鼠伤寒沙门菌（rSt）疫苗表达31 kD 的CSP31、22 kD 的OMP22 和19 kD 的SOD 抗 原。他 们 将rSt-BCSP31、rSt-OMP22、rSt-SOD 和rSt-prpA 按体积比等量混合成为混合rSt 疫苗，口服接种BALB/c 鼠，接种后3 周发现血清IgG 上升，脾细胞释放高水平TNF-α和IFN-γ等细胞因子，此时腹腔注射1×105CFU 布鲁菌544 株进行攻击，攻击后2 周免疫鼠脾的细菌负荷均下降至1/75 左右；然后将1.2×104、1.2×105和1.2×106CFU 混合rSt 疫苗腹腔注射BALB/c 鼠，接种后3 周发现血清IgG 上升，脾细胞分泌高水平TNF-α和IFN-γ，此时腹腔注射1×105CFU 流产布鲁菌544 株进行攻击，攻击后2周显示免疫鼠脾的细菌负荷显著下降，1.2×106CFU 疫苗组的效果最好。

Leya 等[21]将5×1010CFU 混合rSt 疫苗皮下注射10 月龄山羊，血清IgG 在接种后3～6 周上升，接种后6 周达较高水平，接种后6 周脾细胞增殖，释放高水平IFN-γ，此时用5×108CFU 流产布鲁菌544株进行点眼攻击，攻击后8 周免疫羊肝、脾和肺的细菌负荷显著降低。Lalsiamthara 等[22-23]将2×107CFU 混合rSt 疫苗采用口服、肌肉注射、皮下注射和腹腔注射分别接种BALB/c 鼠，接种后4 周腹腔注射2×105CFU 流产布鲁菌544 株进行攻击，攻击后15 d 提示4 个免疫组的脾细菌负荷均有降低，但以腹腔注射接种组的效果较好，随后将1×108CFU 混合rSt 疫苗腹腔注射豚鼠，接种后30 d腹腔注射2×107CFU 流产布鲁菌544 株进行攻击，攻击后30 d 提示接种组的脾细菌负荷下降至1/100 左右。

1.2 卡介苗作为载体

人们发现卡介苗（bacille Calmette-Guerin，BCG）作为载体可以表达曼氏血吸虫的副肌球蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶[24-25]。张亚丽等[26]以布鲁菌 基 因组DNA 为模板，扩增625 bp 的OMP25 基因，插入pMD18-T 得pMD18-OMP25，与pMV261-Ag85B 重组得pMV261-Ag85B-OMP25，采用电穿孔技术导入BCG，用卡那霉素进行选择，Western印迹提示重组BCG 疫苗表达的46 kD 的融合抗原可被布病患者的血清所结合。用腹腔注射途径将1×106CFU 疫苗接种BALB/c 鼠，流氏细胞分选技术（FACS）检测发现外周血单核细胞CD4+和CD8+T 细胞在接种后10～50 d 升高，接种后20 d达较高水平。诸婷婷等[27]以类似方法构建了重组BCG-Bp26 疫 苗，将1×106CFU疫苗皮下注射BALB/c 鼠，接种后30 d 经FACS 证实外周血单核细胞（PBMC）CD4+和CD8+T 细胞数明显增多。

1.3 根癌农杆菌作为载体

植物细胞可以表达变形链球菌的表面蛋白，这为研制转基因植物疫苗提供了可行性[28-29]。王晶妍等[30]以流产布鲁菌16M 基因组DNA 为模板扩增OMP31 基因，插入pJG045 得pJG045-OMP31，采用三亲融合法转化根癌农杆菌AGL0 株，叶盘转化法转染番茄子叶，常规选育转基因植株，从转基因番茄中抽提基因组DNA 作为模板，PCR 可克隆出755 bp 的OMP31 基因。OMP3148-74是一个免疫显性表位，可单独引起免疫反应。赵亮等[31]将BLS-OMP3148-74基因插入pJG045 得pJG045-BLS-OMP3148-74，常规导入根癌农杆菌AGL0 株，转染紫花苜蓿的子叶，选育转基因植株，从转基因苜蓿中抽提基因组DNA 作为模板，PCR 可克隆出566 bp 的基因片段。廖露等[32]将BLS-OMP3148-74基因插入pJG045 得pJG045-BLS-OMP3148-74，常规导入根癌农杆菌GV3101 株，转染烟草子叶，选育转基因植株，从转基因烟草中抽提总RNA 作为模板，RT-PCR可克隆出534 bp 的BLS-OMP3148-74基因片段，但未报道免疫动物的试验结果。

1.4 大肠杆菌作为载体

大肠杆菌是一种疫苗载体，可有效表达外源抗原[33-35]。Guilloteau 等[36]以流产布鲁菌16M 基因组的DNA 为模板扩增OMP31 基因，插入PCRⅡ得pNV3118，将其转化大肠杆菌JM109 株，常规抗生素筛选，Western 印迹提示重组菌表达的31 kD 的OMP31 抗原可被布病患者的血清所结合。用腹腔注射途径将1×108CFU 疫苗接种BALB/c 鼠，在第1 次接种后5 周进行加强，ELISA 提示免疫鼠的血清IgG 水平在第1 次免疫后2～8 周升高，免疫后8 周有明显上升；脾细胞在第1 次免疫后3～6 周明显增殖，免疫后4 周有明显提升。在第1 次免疫后9 周腹腔注射1×104CFU 布鲁菌H38S 株进行攻击，攻击后2 周免疫组的脾细菌负荷无明显减少。Gupta 等[37]以布鲁菌16M 株的DNA 为模板分别扩增OMP31、OMP16、Bp26 基因，插入pDEST17得pDEST-OMP31/OMP16/Bp26，将其转化大肠杆菌BL21-AI 株，常规抗生素筛选，Western 印迹提示重组菌表达的31、16、26 kD 的相应蛋白可被布病患者的血清所结合。用腹腔注射途径将2×107CFU 疫苗接种BALB/c 鼠，第1 次免疫后2 周加强1 次，在第1 次免疫后4 周免疫鼠的血清IgG 和IgG1 水平上升，脾细胞明显增殖，脾细胞CTL 活性显著增强，此时腹腔注射2×104CFU 布鲁菌16M株进行攻击，攻击后3 周免疫鼠脾的细菌负荷下降至1/100 左右。

1.5 酵母作为载体

杨春华等[38]以布鲁菌S2 株的DNA 为模板扩增471 bp 的OMP25 基 因，插入pGEM-T 得pGEMOMP25，与pPIC9K 重组得pPIC9K-OMP25，将其电穿孔转化毕赤酵母，筛选阳性菌株，免疫印迹提示布病患者的血清结合重组酵母表达的25 kD 的OMP25 蛋白。王勇等[39]以布鲁菌S19 株的DNA 为模板扩增650 bp 的OMP25 基因，插 入pGM-T 得pGM-OMP25，与pGBKT7-Lam重组得pGBKT7-OMP25，用电穿孔技术导入酿酒酵母Y187 株，常规选育重组酵母，从重组酵母中抽提基因组DNA作为模板，用PCR 方法可克隆出650 bp 的OMP25基因，保护力试验正在进行中。

2 以病毒为载体的布鲁菌OMP 疫苗

2.1 禽流感病毒作为载体

禽流感病毒的基因组含有大量非必需区，删除后基本不影响病毒的复制和转录，可以作为载体使用[40]。L7/L12 蛋白是布鲁菌的核糖体蛋白，参与该菌的胞内蛋白合成，将L7/L12 重组蛋白或其脂质体接种BALB/c 鼠可有效对抗布鲁菌544株的攻击感染[41-42]。Tabynov 等[43-45]将布鲁菌OMP16 和L7/L12 基因分别插入禽流感病毒H5N1和H1N1 株的非结构蛋白1（nonstructural protein 1，NS1）的开放读框后转染Vero 细胞，筛选重组病毒Flu-NS11-24-OMP16-H5N1、Flu-NS11-24-L7/L12-H5N1、Flu-NS11-24-OMP16-H1N1 和Flu-NS11-24-L7/L12-H1N1，然 后 将Flu-NS11-24-OMP16-H5N1 和Flu-NS11-24-L7/L12-H5N1 混合为重组H5N1 病毒，将Flu-NS11-24-OMP16-H1N1 和Flu-NS11-24-L7/L12-H1N1 混合为重组H1N1 病毒。接着，将106EID50混合重组H5N1 病毒采用滴鼻、点眼和皮下注射分别接种豚鼠，初次接种后28 d 用106EID50混合重组H1N1 病毒进行加强，初次接种后60 d用5×108CFU 布鲁菌544 株皮下注射进行攻击，攻击后30 d 发现滴鼻组、点眼组和皮下注射组的脾细菌负荷分别下降至1/1000、1/10 000 和1/100 左右，提示点眼接种是较好的免疫途径。随后，将108EID50混合重组H5N1 病毒采用点眼和皮下注射分别免疫怀孕的小母牛，初次接种后28 d 用108EID50混合重组H1N1 病毒进行相应加强，初次接种后60 d 腹腔注射5×108CFU 布鲁菌544 株进行攻击，攻击后30 d 发现皮下注射组脾的细菌负荷显著低于点眼组，阻止流产率为80%（8/10）。最后，将108.5EID50混合重组H5N1 病毒点眼免疫小牛，初次接种后28 d 用108.5EID50混合重组H1N1 病毒进行加强，初次接种后56 d 血清IgG、IgG1 和IgG2a 上升，淋巴结细胞分泌高水平IFN-γ，FACS 提示淋巴结内CD4+和CD8+T 细胞数显著增加；初次接种后60 d 用5×108CFU 布鲁菌544株皮下注射进行攻击，攻击后30 d 免疫牛淋巴结的细菌负荷下降至1/1000 左右。

2.2 山羊痘病毒作为载体

山羊痘病毒的宿主范围窄，不感染人类，是一种理想的疫苗载体，已成功表达牛瘟病毒的血凝素[46]。魏凤等[47]以布鲁菌DNA 为模板扩增OMP25 基因，插入pGM-TK-GPT1 得pGM-OMP25，将重组质粒加入山羊痘病毒的基因组共同转染绵羊成纤维细胞，筛选重组病毒，从重组病毒中抽提基因组DNA 作为模板，用PCR 方法可克隆出642 bp 的OMP25 基因，但未报道保护力的结果。

2.3 牛痘病毒作为载体

Tine 等[48]报道牛痘病毒的MVA 减毒株可表达恶性疟原虫的PfCSP、PfSSP2、PfMSP1 和PfS25 等，可作为一种有用的载体。Vemulapalli 等[49]以布鲁菌S19 株的DNA 为模板扩增OMP18 基因，插入pMCOZ 得pMCOZ-OMP18，将重组质粒加入牛痘病毒的WR 株后共同转染Vero 细胞，筛选重组病毒，免疫印迹提示布病患者的血清结合重组病毒表达的18 kD 的OMP18 蛋白。

3 结语

以细菌和病毒作为载体的布鲁菌OMP 菌苗接种小鼠可有效对抗该菌有毒株的攻击，但报道的保护力水平差强人意，需要进一步的研究。随着对布鲁菌组学研究的深入以及表观遗传学的探索，人们必将弄清布鲁菌外膜抗原结构与功能的关系，从而在候选基因或编码该基因的相关表位选择上占据有利位置；现有的表达载体存在不足，这就需要摸索新的表达途径；混合基因疫苗或多表位疫苗的研制还不理想；尚未解决疫苗的转化效率低、免疫原性不足和MHC 限制性等诸多问题；疫苗的生产工艺和质量控制还未进行规范；能否引入纳米微粒技术研制布鲁菌疫苗，从而延长免疫应答的时间，诱导记忆性T 细胞的产生。深入思考这些问题，有助于细菌和病毒作为载体的布鲁菌OMP 菌苗的研制，从而为布鲁菌的免疫预防提供新途径。