基于肽生物标志物技术鉴别肉品的真实性研究进展

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(1.国家胶类中药工程技术研究中心,山东聊城 252201;2.东阿阿胶股份有限公司,山东聊城 252201)

肉制品中含有丰富的优质蛋白和微量元素,其营养价值高且口味独特,在世界各国的居民食品消费中都占有较大的比重[1]。肉类市场需求的增加和不同物种肉的价格差异,导致了肉品行业掺假盛行,近期最引人关注的便是河北省河间市驴肉掺假事件[2]。肉制品掺假不仅侵犯了消费者的合法权益,而且严重冲击了宗教信仰,另外,使用某些患有传染病的不合格肉冒充新鲜肉,还可能造成疫病传播和易感人群的过敏等食品安全问题。

目前,以核酸和蛋白质为基础的检测方法已广泛应用于肉制品的真实性鉴定。基于核酸的检测方法主要通过聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术来实现,包括常规PCR技术[3-4]、限制性片段长度多态性PCR(PCR-RFLP)技术[5-6]、多重PCR技术[7-8]、实时荧光定量PCR技术[9-10]和微滴数字PCR技术[11-12]等;基于蛋白质的检测方法则主要集中于酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技术[13-14]。此两类肉品真实性鉴定方法,特异性强、灵敏度高且定量准确,但同时也存在着一些弊端。首先,对于加工肉制品而言,核酸和蛋白质在高温高压条件下,易发生降解[15]和变性,严重影响了定性和定量结果的准确性。其次,对于复杂的肉品基质,PCR反应易受基质效应的干扰[16];而ELISA方法,则无法实现同一反应中多个物种的同时检测。第三,对于亲缘关系较近的物种,ELISA方法易发生物种间的交叉反应[17],产生假阳性结果;而PCR反应则需要反复的引物优化,费事费力。

伴随着蛋白质组学的发展,以肽生物标志物为基础的液相色谱-串联质谱(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技术逐渐应用于肉制品的真实性鉴定[18-19]。所谓的肽生物标志物是指具有物种相对特异性的多肽序列,即该多肽序列仅特异性的存在于本物种中,而在研究中的其他物种中不存在。与核酸和蛋白质相比较,多肽序列具有更高的稳定性,能够耐受高温高压和其他严峻条件的考验[20];同时,作为DNA的表达产物,多肽具有更高的组织特异性,能很好的区分开不同物种肉;最后,该方法借助于高灵敏度高扫描速度的LC-MS仪器,可以很容易的实现多个物种的同时检测,节约时间、提高检测效率。

本文主要从肉中肽生物标志物的分离鉴定方法、肽生物标志物在鉴定不同肉制品及肉制品中外源蛋白的应用三个方面进行论述,并对肽生物标志物在鉴定肉品真实性应用中的发展方向进行展望,以期为食品溯源提供更丰富的技术手段。

1 肉中肽生物标志物的分离鉴定

1.1 肉中蛋白质和多肽的分离技术

肉中蛋白质含量丰富且种类多样,采用传统的蛋白质分离技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、液相色谱等很难将其分离开来,这就给以蛋白质为基础的肉品真实性鉴定方法带来了困难和挑战。伴随着蛋白质组学的发展和分析仪器的不断升级,高灵敏度、高扫描速度的质谱技术已开始应用于肉中蛋白质和多肽的分离鉴定,其中应用较多的为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)[18,21]、电喷雾飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)[22]、三重四级杆质谱[23-24]和液滴萃取表面分析质谱(Liquid extraction surface analysis mass spectrometry,LESA-MS)[25-26]。

使用质谱技术对肉中的蛋白质和多肽分离主要集中在以下两种方法。第一种方法为基于特定蛋白质中多肽的分离鉴定,即不同肉制品经蛋白质提取、SDS-PAGE分离和目标蛋白质的切胶酶解等前处理过程,最后使用质谱仪对特定蛋白质的酶解肽段进行分离鉴定,其中应用最多的质谱仪为MALDI-TOF-MS[18,27]。利用该方法可以很容易的实现不同物种肉中单一蛋白质的氨基酸组成分析,进而找出该蛋白的氨基酸序列在不同物种肉中的差异,利用这些差异性的肽段实现对不同物种肉的真实性鉴定[18]。但该方法也存在着样品前处理复杂,费时费力的缺点。第二种方法为基于全蛋白的多肽分离鉴定,即不同肉制品经蛋白质提取和胰蛋白酶消化两步处理后,直接进行蛋白质和多肽的分离鉴定[22,28]。该方法无需复杂的蛋白质凝胶分离过程,节省时间和人力[22-24,28];消化后的多肽样品经一次分离鉴定,就可获得该物种的绝大多数蛋白质和多肽,与特定蛋白质中的多肽分析相比较,此方法得到的肽生物标志物信息更加丰富可靠。但同时该方法也存在着数据处理繁琐的缺点。

1.2 肉中蛋白质和多肽的鉴定方法

蛋白质酶解产物经LC-MS电离分析后,将提取到每个肽段的质谱图,而得知每个肽段的蛋白质种属来源和氨基酸组成,则需进一步借助蛋白质数据库进行对比分析。目前,基于数据库检索的方式鉴定蛋白质和多肽序列的方法主要有两种,一是肽指纹图谱(Peptide mass fingerprint,PMF)技术[19,29],即蛋白质经特异性的酶(通常为胰蛋白酶)酶解后,采用质谱技术对酶解后的多肽混合物进行质量分析,这些特征性多肽的质量就构成了该消化蛋白的肽指纹图谱。蛋白分析时,将这些肽段的质量与数据库中所有蛋白质的理论酶切结果相比较,根据得分的高低来实现对未知蛋白的鉴定。PMF的关键是准确测量不同肽段的分子质量,但当蛋白质出现翻译后修饰的现象,会引起肽分子质量的迁移,使PMF的质量数与理论值不相符合,给蛋白质的鉴定带来困难,这一定程度上限制了该技术的应用。第二种方法为肽碎片离子鉴定法。在串联质谱的低能量碰撞诱导解离(Collision-induced dissociation,CID)模式下,将待测肽段的峰打碎,通过计算相邻同类型峰的质量差,同时结合肽段母离子的质量,实现对未知肽段的氨基酸组成分析[30]。但在实际的氨基酸序列解析中,由于不同的碎片可能带有不同的电荷、肽段的类型不单一或有杂质分子的干扰,都会给氨基酸序列的解析带来影响。

1.3 肉中肽生物标志物的找寻及确认

LC-MS法鉴别不同肉制品最为关键的是:找寻到不同物种肉的特异性肽生物标志物。在肉类掺假鉴定中,所谓的特异性肽生物标志物是指:该多肽序列仅特异性的存在于本物种中,而在研究中的其他物种中不存在,且该肽段所对应的蛋白质为高丰度蛋白[22,31]。目前,主要通过数据库检索的方式,实现潜在肽生物标志物的找寻。在利用数据库找寻目标物种的潜在肽生物标志物时,首先应找出在所有研究物种中同时存在的蛋白质,之后比较该蛋白在不同物种中的氨基酸组成,最后找出仅在目标物种中存在的特异性肽段,这些特异性肽段就为目标物种的潜在肽生物标志物。通过数据库检索到的潜在肽生物标志物,可能会由于数据库的缺失或物种亲缘关系较近,而产生假阳性的结果,因此有必要对潜在肽生物标志物进行实际物种测试,以进一步确认其特异性。

伴随着质谱仪器的发展,四级杆质谱的多反应监控(Multiple-reaction monitoring,MRM)扫描模式已成功运用于肽生物标志物的特异性分析。MRM是基于肽的已知或者假定信息,有针对性的获取质谱数据的一种技术。具体地,MRM是根据多肽的母离子和子离子的质量数信息,构建出该肽的母离子/子离子对,符合要求的母离子进入碰撞室,碰撞打碎后,在二级扫描中记录子离子信号,通过母离子和子离子的前后两次选择,可以有效的排除干扰,提高方法的特异性和灵敏度[32]。

MRM确认肽生物标志物的特异性具有很多优势。首先,准确度高;MRM实现了对特定肽段的多个母离子/子离子对的双重选择鉴定,特异性强,准确度高。其次,结果容易观察;判断肽生物标志物的特异性,只需观察该肽在不同物种中的MRM峰保留时间,无需其它繁杂的数据处理。第三,快速高效;根据不同肽段的出峰时间,可以实现一次进样数百个肽段的同时分析鉴定。此外,MRM方法除了可以确认肽生物标志物的特异性外,还可以实现蛋白质组学中的定量分析[33]。

2 肽生物标志物在鉴定不同肉制品中的应用

蛋白质作为DNA的表达产物,与DNA相比较,蛋白质具有更高的组织特异性,而DNA 在同一个体不同组织之间没有差异[34],同时,多肽链的氨基酸组成作为蛋白质的基本结构,具有很高的特异性和稳定性,能很好的耐受外界环境(高温、高压和酸碱度)的干扰。伴随着蛋白质组学的兴起,以特异性肽生物标志物为基础的LC-MS方法逐渐用于肉制品的真实性鉴定[35]。

Taylor等[36]首次采用质谱技术,对来自不同物种中的血红蛋白和肌红蛋白进行了分析比较,并提出了该技术可以潜在的应用于不同物种肉的鉴定。2010年,Sentandreu等[18]提出了一种基于蛋白质组学的方法,检测混合肉中的鸡肉成分;首先使用LC-MS技术对鸡肉中的肌球蛋白轻链3酶解产物进行分析鉴定,之后分别绘制不同比例鸡肉含量的混合肉与鸡的肽生物标志物丰度之间的标准曲线,并以此来进行混合肉的定量分析,结果显示该方法可以检测出猪肉中0.5%的鸡肉含量。伴随着2013年欧洲“马肉丑闻”的曝光以及PCR技术在检测加工肉制品中的缺陷,越来越多的研究集中于利用肽生物标志物技术检测肉制品中的马肉[22,27]和清真肉[28,37]成分。液滴萃取表面分析质谱(LESA-MS)作为一种新的分析技术,也已开始应用于肉制品的真实性鉴定中[25-26,38],且有报道该方法比传统的电喷雾质谱(ESI-MS)技术有更高的灵敏度和稳定性[25]。国内,以肽生物标志物技术检测肉制品的真实性研究起步较晚,李莹莹等[39]利用蛋白质组学的方法找寻出羊肉和鸭肉的特异性多肽,并分别选择两种肉响应较好的5条特异性多肽进行定量分析,结果表明,该方法可以检测出羊肉中0.5%的鸭肉含量。张颖颖等[40]建立了一种定量牛肉中猪肉和鸡肉成分的LC-MS方法,首先采用高分辨率质谱分别找出牛肉、猪肉和鸡肉的潜在肽生物标志物,之后采用质谱MRM模式,对潜在肽生物标志物进行特异性确认,最后分别选择3种肉的3组特异性肽进行定量分析,结果显示,该方法与较常用的PCR方法检测结果相一致,定量限达到0.5%,特异性强准确度高。除用廉价的肉代替高昂的肉制品掺假外,在肉中添加其他外源性蛋白也是肉制品掺假的一种常见方式,接下来对以肽生物标志物技术检测肉制品中的外源性蛋白成分进行综述。

3 肽生物标志物在鉴定肉制品中外源蛋白的应用

外源蛋白质的添加可以明显改善肉制品的功能性质,例如增加肉的持水性和改进肉的组织结构等[41],同时,外源蛋白质的添加也降低了肉制品的加工成本,给一些不法分子带来可乘之机。现在,一些国家的法律法规已明确禁止或限制在肉类加工过程中蛋白质的添加量,因此,有必要开发一种强有力的分析技术来控制这种欺诈行为。肽生物标志物技术作为一种有效的分析方法,已开始应用于肉制品中外源蛋白的分析检测。

Leitner等[42]开发了一种以蛋白质和多肽为标志物的方法,鉴定加工肉制品中的大豆蛋白成分,包括大豆分离蛋白的提取和预分离、胰蛋白酶的消化以及LC-MS的分离鉴定,结果表明,该方法能很好地区分肉制品中的大豆蛋白成分,且可以用于定量分析。Hoffmann等[43]建立了一种同时检测肉制品中羽扇豆、豌豆和大豆成分的LC-MS方法,样品经蛋白质提取、胰蛋白酶消化和LC-MS分析鉴定后,每种豆类分别选取3～4个肽生物标志物进行定量分析,结果表明,该方法可以最低检测到肉制品中2、5和4 mg/kg的羽扇豆、豌豆和大豆成分,方法特异性高,无交叉污染。

外源蛋白的添加除降低加工成本外,还可能会引起易感人群的过敏症状[44],利用肽生物标志物技术找寻不同食品中的过敏原也是蛋白质组学的一个研究方向。Heick等[45]开发了一种同时检测不同食物中七种过敏原的LC-MS方法,检测结果与市售ELISA试剂盒分析结果相比较,两者无显著性差异。Montowska等[46]利用LC-QTOF-MS技术开发了一种检测禽肉制品中非肉类蛋白成分的方法,利用该方法可以检测到加工禽肉制品中关于大豆、牛奶和蛋清蛋白中的43个、9个和12个热稳定性肽生物标志物,且这些多肽所对应的蛋白多为致敏性蛋白。

4 肽生物标志物在鉴定肉品真实性应用中的发展方向

检测速度是评价检测方法优劣的一项重要指标,以肽生物标志物为基础的肉品真实性鉴定方法的检测速度,很大程度上依赖于蛋白质的消化速率。在目前的相关研究中,为了获得最大的蛋白质覆盖率,提取到的肉类蛋白质通常在胰蛋白酶消化液中,37 ℃条件下反应12 h,此过程是耗时的,很难适应肉制品的快速定性和定量分析。此前已有报道,通过微波[47]、高压[48]和超声[49]的方式可加速胰蛋白酶的消化过程,Carrera等[50]利用高强度聚焦超声的方式辅助胰蛋白酶的消化,成功用于不同鱼类物种的分析鉴定,且整个消化过程只有2 min。消化时间的缩短可最大限度的减少样品前处理时间,后续仅需约20 min的LC-MS采集时间即可完成对肉品真实性的认证,检测时间远短于传统的荧光定量PCR方法。

肽生物标志物的特异性关系到整个LC-MS方法的准确度。伴随着蛋白质组学的发展和质谱仪器的更新换代,新一代的MRM3扫描在定量分析中表现出独特的优势,该技术能很好的降低背景噪音,消除非目标峰的干扰,提高定量结果的灵敏度,目前,该技术已在von Bargen[22-23]的研究中得到尝试。此外,平行反应监测(Parallel reaction monitoring,PRM)作为MRM的升级技术,能够实现对目标蛋白质和肽段的选择性检测,从而实现对目标蛋白质或肽段的绝对定量分析。

5 结语

肽生物标志物技术作为一种新兴的肉品真实性鉴定手段,其特异性、灵敏度和准确性都能与传统的PCR方法相媲美。除此之外,该技术还存在着稳定性强和快速高效的特点,这就使得该方法对大量的、复杂的和不同加工程度的肉制品分析更有优势。该方法的提出,不仅丰富了肉品真实性鉴定手段,打击了不法犯罪,而且对整个食品行业的溯源工程也起到了积极的推动作用。

同时,作为一种行之有效且非常有前途的分析方法,肽生物标志物技术在今后的肉制品真实性鉴定方面具有以下发展趋势:不断优化样品前处理过程,提高检测方法的重复性;缩短全过程检测时间,提高检测速率;伴随分析仪器的更新换代,提高检测方法的特异性和灵敏度。

总之,伴随着样品前处理方法的改进和蛋白质组学的日渐成熟,以肽生物标志物为基础的LC-MS技术在物种的认证和检测肉制品的真实性方面有着广阔的发展空间。