功能材料在蛋白质组研究中的应用进展

相小超, 焦丰龙, 张养军, 钱小红, 秦伟捷

(军事医学研究院生命组学研究所, 北京蛋白质组研究中心, 国家蛋白质科学中心(北京) 蛋白质组学国家重点实验室, 北京 102206)

蛋白质组学研究器官、组织或细胞内所有蛋白质及其动态变化规律,本质上是在大规模水平上、从整体角度研究蛋白质的特征、动态变化、表达水平、翻译后修饰以及蛋白质与蛋白质的相互作用等的一门科学[1]。而从组学层面对蛋白质进行研究,仍受多种因素的限制,例如不同蛋白质表达量差异巨大、翻译后修饰的官能团种类繁多、动态范围广及蛋白质本身的空间结构复杂等[2],因此,在表达谱的深度覆盖、翻译后修饰的准确鉴定及蛋白质组的定量等方面,现在的蛋白质组学技术还存在很多缺陷。为此,近年来,研究者们尝试将各种功能材料应用到蛋白质组学分析中,对样品预处理的分离技术进行优化,从而达到高灵敏度鉴定,高准确性分析,高通量表达,精确测量生物样本中蛋白质表达量变化的目的。本文对功能材料的介绍主要从应用于蛋白质酶切的功能材料、用于转录因子富集的功能材料、用于翻译后修饰蛋白质组研究的功能材料以及蛋白质组定量研究的功能材料这四个方面进行综述,并对功能材料在蛋白质组学方法研究中的应用进展予以展望,可为功能材料在蛋白质组学方法研究中的应用提供参考。

1 功能材料在蛋白质酶切中的应用

目前,基于生物质谱的“bottom-up”研究策略是蛋白质组学研究的最常用手段,在此策略下,蛋白质先被酶切成肽段,再进行质谱分析,根据谱图分析结果,对蛋白质进行定量定性分析[3]。因此,酶切是基于质谱蛋白质组分分析的关键步骤,而传统溶液酶切时间较长、酶切效率低,并且存在自切现象,影响了蛋白质组学的深度覆盖研究,而固定化酶技术由于可以大幅度提高酶解速度,增加酶活性和稳定性,避免蛋白酶自切片段的产生而改善谱图质量,并可反复使用,得到了广泛关注[4]。固定化酶是在一定的空间范围内起催化作用,并能反复和连续使用的酶。在固定化酶技术中,载体材料上的活性基团、微环境、载体的形状等因素,会影响载体与酶的亲和力,影响固定化酶活力、稳定性、重复使用性及可回收性[5]。所以对载体材料的研究也变得至关重要。

磁性纳米材料具有比表面积大、可增强酶活性和稳定性、磁响应性强、易在表面修饰多种功能基团等优点,是固定化酶常用的载体材料,用于蛋白质组学方法的研发中以应对蛋白质组研究面临的各种挑战[6]。酶切是蛋白质分析方法中的关键步骤之一,为了解决蛋白质组分析中快速、完全酶切的问题,杨屹课题组[7]建立了一种新型固定化酶反应器,利用磁性纳米粒子作为固定化酶载体,通过DNA定向固定化技术成功地固定碱性磷酸酶(ALP),并利用DNA链置换反应将胰蛋白酶(trypsin)在温和条件下置换ALP,从而将胰蛋白酶固定化,实现了酶的替换。实验表明,该固定化酶反应器具有较好的选择性和较高的酶切效率,重复使用10次仍可保持原酶活性的86%。该反应器具有高磁响应性,便于回收固定酶和重复使用,节约实验成本,可将其广泛应用于各种酶促反应中。吕永琴等[8]制备了一种可重复使用的酶固定化载体AuNP@Fe3O4纳米颗粒,该载体由涂覆一层金纳米颗粒(AuP)的磁性Fe3O4纳米颗粒组成,金纳米颗粒充当中间配体,然后将胰蛋白酶可逆地固定在该载体上。实验结果表明,基于该载体材料的固定化胰蛋白酶反应器可以在15 min内实现标准蛋白质的完全酶切,还可以在蛋白质酶切后,利用磁铁对纳米材料进行回收重复使用。李笑迎等[9,10]还利用孔径介于2～50 nm的一类介孔材料具有较高的载酶量、较大的比表面积、可调节孔径、良好的化学稳定性等优点,对其在固定脂肪酶中的应用进行了研究,他们先以三乙烯四胺为固化剂,在聚乙二醇介质中通过环氧树脂聚合反应诱导相分离制备出环氧树脂大孔聚合物,再以制备好的环氧树脂大孔聚合物为模板,制得了毫米级尺寸的大孔/介孔多级孔SiO2材料。这种材料是由连续SiO2纳米薄膜构建的,不仅具有三维连续贯通的大孔孔道,而且孔壁上存在大量介孔,能有效提高酶活性,增加载酶量,能使固定化酶易从体系中分离和重复使用,操作过程简单且固定化成本降低,是固定化酶的优良载体。Singer等[11]制备了具有大孔的功能化介孔二氧化硅纳米粒子材料(LP-MSN),并通过铜催化的1,3-偶极环加成反应,将两种不同的乙炔功能化酶(sp-碳酸酐酶和sp-辣根过氧化物酶)固定在获得的LP-MSN材料的孔中。合成的LP-MSN尺寸范围约为100 nm,有大至12 nm的孔径,成为活跃的、稳定的、可重复使用的酶-二氧化硅系统,可在几个循环的活性测定期间中保持高活性。钱小红课题组[12]利用温敏聚合物对外界温度具有响应能力的性能,制备了一种新型的基于可溶性温敏聚合物的固定化胰酶反应器,即将N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)作为温度响应基团,合成了具有最高临界溶解温度响应能力的N-丙烯酰甘氨酰胺共聚十一烯醛(poly(NAGA-co-UnAl))温敏聚合物,再将该温敏聚合物作为载体材料,制备得到新型可溶性温敏固定化胰蛋白酶。他们又通过控制反应体系温度使固定化酶对蛋白质样本实现了酶解和分离,有效解决了固定化蛋白酶酶解时存在的固液界面传质阻力和空间位阻的问题,缩短了酶解时间,提高了酶解效率,实验结果证明该材料在固定化酶技术应用中具有潜力。

功能材料在蛋白质酶切过程中的应用实例说明随着各具特色新型载体的出现,将借此制备出各种高效固定化酶反应器,为蛋白质组深度覆盖及定量分析发挥作用。

2 功能材料在转录因子富集中的应用

转录因子(transcription factor, TF)作为一种具有特殊结构,能行使调控基因表达功能的蛋白质分子,在蛋白质表达中起着至关重要的作用。但是目前的技术手段仍不能有效得到深度覆盖转录因子。将功能材料用于转录因子富集中,发展高效、高特异性的转录因子富集技术,对蛋白质组学、基因组学和转录组学的研究至关重要。为此,谢辉等[13]为了解决转录因子丰度低、难以直接进行质谱鉴定的问题,基于磁性功能材料和效应元件设计了可以高效富集肺癌组织的转录因子富集技术(TFRE)。他们利用转录因子能与序列特异性DNA元件结合的特点,合成了含有大多数转录因子结合位点的DNA序列,并将此序列键合在载体上,然后在体外扩增生物素标记的PCR引物,从而得到生物素标记的DNA序列。再以生物素和亲和素之间的独特结合特性为基础,将“DNA诱饵”偶联到链霉亲和素标记的磁珠上,然后再与预先制备好的组织核蛋白一起孵育,得到DNA-蛋白复合物,再经电泳和胶内酶解之后进行质谱鉴定。实验结果表明TFRE技术可以高效地对肺癌组织中的转录因子进行富集。谢辉等[14-16]还开发了一种高灵敏度、高选择性、高通量等优点的TOT(TFRE on Tip)技术,可用于富集鉴定内源性TFs。这种技术是将级联串联转录因子效应元件(catTFRE)作为亲核试剂富集转录因子,规模化定量内源性TFs,解决了catTFRE单独应用存在的问题,能更高效、更精确、高通量地反映信号变化。实验结果表明,TOT技术可从微量样本中筛选TFs,达到高效富集内源性TFs的目的,在细胞信号转导等功能研究中起到关键作用。这些应用实例表明功能材料在生物学研究中可发挥独特作用。

3 功能化材料在翻译后修饰蛋白质组研究中的应用

蛋白质翻译后修饰(PTMs)是通过对蛋白质侧链和末端进行化学修饰或者是被蛋白水解酶酶切来改变蛋白质性质的共价加工过程[17]。PTMs包括磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化、泛素化、类泛素化等多种修饰[18]。PTMs可以通过调节蛋白质的活性、亲疏水性、稳定性和空间结构,从而影响蛋白质的功能,最终改变细胞的表型特征和生物学功能,参与调节机体的许多生命活动,如基因表达、细胞分化与凋亡、信号转导等,也与多种肿瘤的发展密切相关[19]。但大多数发生翻译后修饰的蛋白质通常具有丰度低、动态范围宽以及结构复杂等特点,因此对蛋白质翻译后修饰进行规模化分析面临着巨大的挑战。对复杂生物样品中翻译后修饰蛋白质和肽段进行选择性富集,是实现翻译后修饰蛋白质组学规模化分析鉴定的关键步骤。

蛋白质磷酸化修饰是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰,蛋白质通过磷酸化修饰可以调控蛋白质的生物活性、影响信号传递过程[20]。但由于磷酸化修饰蛋白质丰度低、动态范围广,且酶解后磷酸化肽段离子化效率低,使得直接对磷酸化修饰蛋白质酶切样品进行质谱分析变得十分困难,需要对样品中的磷酸化肽段进行选择性的富集[21]。目前有许多方法应用于磷酸化肽段富集,如固相萃取/固相微萃取、金属氧化物亲和色谱、固定金属离子亲和色谱、离子交换色谱、基于抗原-抗体相互作用的免疫亲和富集方法等,但这些常用的方法存在磷酸肽富集特异性差、材料与溶液分离不完全、样品损失、富集操作繁琐、耗时长等不足,为了解决这些不足,研究者们不断设计和制备新型富集材料,寻找具有更好富集特性的功能富集材料[22]。

金属氧化物色谱法(MOAC)是磷酸肽富集的一种常用方法。近年来,多种金属氧化物(如TiO2、ZrO2、Al2O3等)被用于磷酸肽的选择性富集。二氧化钛是目前较为成熟的金属氧化物富集材料。钱小红课题组[21]构建了TiO2串联反相填料的离心式富集装置,结合抗体免疫沉淀,将磷酸肽的富集和分离有机结合。通过用自制的TiO2和反相填料装填小柱将磷酸肽从复杂样品中分离出来,并将富集产物分离成不同馏分,降低了体系的复杂程度,再通过抗体特异性地富集酪氨酸磷酸肽,提高了富集的选择性,减少了样品的损失和人力物力的损耗。

研究人员还发现基于多金属氧酸盐(POM)的磁性材料在蛋白质吸附方面具有较大的应用潜力。POM是过渡金属离子的高氧化态(如钒(V)、钼(Mo)、钨(W)等)与氧形成的纳米级金属-氧簇类化合物。基于POM具有丰富的化学位点和显著的金属氧化物表面特征,贾琼等[23]制备了多金属氧酸盐/壳聚糖磁性复合材料,再结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测手段,用于对磷酸肽的检测分析。实验通过对β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集性能考察表明,这种磁性复合材料可以有效地对磷酸化肽进行富集,避免非磷酸化肽段的影响。冯钰锜等[24]也对金属氧化物材料进行研究改进,采用液相沉积法制备了纳米氧化锆沉积棉花纤维(ZrO2-CF)材料,对材料表征,并将其应用于磷酸化多肽的选择性富集。实验结果表明,脱脂牛奶酶解物经过ZrO2-CF富集后,非磷酸化多肽被有效去除,有9个磷酸化多肽被检测到,较直接用基质辅助激光解析电离飞行时间(MALDI-TOF/TOF)质谱分析(检测到6个磷酸化多肽),质谱信号更强,灵敏性更高。

固定金属亲和色谱(IMAC)是目前广泛应用的一种磷酸肽富集方法,其原理是带正电的金属离子与带负电的磷酸基团发生相互作用而结合[25]。制备IMAC的核心是螯合金属离子的基质材料制备,根据基质材料性质不同可分为纳米材料、微球色谱基质、棉纤维、分子印迹材料、整体材料、共价有机骨架材料等[26]。冯钰锜等[27]选择表面有大量羟基的棉花作为材料进行功能化修饰,在棉花的纤维表面修饰聚多巴胺(PDA),然后利用儿茶酚羟基固定Ti4+,设计合成了一种固定金属亲和色谱(IMAC)材料Cotton@PDA-Ti4+。该材料具有良好的生物相容性,机械性能稳定,化学性能稳定,实验结果表明,Cotton@PDA-Ti4+可以有效地将磷酸化多肽从非磷酸化多肽的体系中分离出来,有较高的富集效率。Dai等[28]还将DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)作为螯合配体涂覆在TiO2纳米材料表面,螯合锆离子Zr4+,形成了新的IMAC材料TiO2@DOTA-Zr。该材料具有较大的比表面积和较强的亲和力位点,同时DOTA与Zr4+之间极强的结合相互作用力增加了固定Zr4+的数目,有效减少了金属离子的损失,增强了对磷酸肽的富集选择性,成功应用于富集脱脂牛奶和人血清样品的胰蛋白酶消化物中的磷酸肽。李嫣等[29]通过溶剂热反应合成Fe3O4微球,再在表面上进行多巴胺的自聚合反应,通过利用PDA的羟基和氨基结合各种金属离子(Ti4+、Nb5+、Zr4+、Ce4+、Ga3+、Y3+、In3+和Fe3+),成功合成了涂覆有各种金属离子的Fe3O4@PDA微球。对磁性微球进行表征后,基于磷酸肽与金属离子的结合亲和力,对磷酸肽进行富集,实验结果显示,不同的金属离子在选择性、灵敏度和真实复杂样品的富集能力方面表现不同,而Fe3O4@PDA-Nb5+和Fe3O4@PDA-Ti4+相较于其他离子具有更好的磷酸肽富集能力。王和平等[30]通过将钛离子直接固定在富含TpPa-2COF的富氮骨架中,制备了钛离子修饰的共价有机骨架材料TpPa-2-Ti4+,用于磷酸肽的特异性富集。该材料对于β-酪蛋白磷酸化多肽的检测限低至4 fmol,提高了选择性(β-casein∶bovine serum albumin (BSA)=1∶100, m/m),同时实现了对磷酸肽的高灵敏度、高选择性的富集。

蛋白质糖基化修饰也是一种重要的翻译后修饰,它以各种方式广泛参与基本生物学过程,包括基因转录、基因表达、蛋白质翻译调控、信号转导、蛋白质降解、受体激活等[31]。由于糖肽丰度低、糖链结构复杂、糖基化位点的微观不均一性、糖肽的离子化效率差以及肽段的质谱信号受到非糖肽的信号抑制,导致直接用质谱分析糖基化蛋白面临许多挑战[32]。因此质谱分析糖基化蛋白或糖肽前对复杂生物样品中的糖蛋白或糖肽进行选择性分离富集是成功鉴定糖蛋白或糖肽的关键。近年来,许多方法被应用于在复杂生物体系中选择性的分离和富集糖蛋白或糖肽,主要有凝集素亲和色谱法、肼化学法、硼酸化学法和亲水相互作用色谱法等[33,34]。许多材料也被应用于糖蛋白或糖肽的富集和分离,主要有磁性微球[35]、磁性纳米颗粒[36,37]、氧化石墨烯[38]、介孔材料[39]、金属有机骨架材料(MOFs)、共价有机骨架材料(COFs)[40]等。

氧化石墨烯功能材料便是一例。氧化石墨烯是在石墨烯的基面和边缘连接上大量含氧基团形成的,是一种性能优良的新型二维碳纳米材料,具有较好的导电导热性能、有较大的比表面积和表面丰富的含氧官能团,在糖肽富集中有较好的应用[41]。为了解决应用于凝集素富集的功能化材料存在负载量偏低以及富集效率有限等问题,钱小红等[42]将麦胚凝集素(WGA)和伴刀豆凝集素A(Con-A)的自由氨基与GO(氧化石墨烯)表面的羧基通过偶联反应键合在GO表面,成功合成了高负载量的氧化石墨烯固定化凝集素GO-WGA和GO-ConA(固载量>1.90 mg/mg)。这两种固定化凝集素可以针对不同糖型的糖蛋白进行富集,而且材料制备容易,富集操作简单,负载量高。蒋波等[43]通过在聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯表面负载金纳米颗粒,然后通过形成Au-S键在表面固定4-巯基苯硼酸,合成了4-巯基苯硼酸功能化氧化石墨烯复合物(GO/PEI/Au/4-MPB复合材料),并将其用于糖肽的选择性富集和分离。研究结果表明,该复合材料在N-糖肽的捕获中显示出高的选择性和灵敏度,而且该材料具有较强的亲水性,与胰蛋白酶BSA特异性结合,在复杂生物样本中有较好的应用前景。该实验室还使用聚乙烯亚胺作为还原剂和固定试剂,在磁性氧化石墨烯上键合金纳米颗粒合成了亲水性GO/Fe3O4/Au/PEG纳米复合材料,然后通过硫醇末端聚乙二醇固定化实现对糖肽的高选择性富集。该材料具有二维结构和优异的亲水性,可以从人血清中鉴定出255种糖肽,证明了该材料在糖基化分析中的应用潜力[44]。

另外,磁性微球是一种新型的磁性功能材料,是通过适当方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。磁性微球具有可控的磁学性能、超顺磁性、具有生物相容性、表面易被官能团修饰、材料简单易获得等优点,能实现样本溶液与材料的快速分离,被广泛应用于糖肽的富集[45]。邓春晖等[46]将葡萄糖-6-磷酸作为官能化基团连接到Fe3O4磁性微球表面上,成功制备了亲水性Fe3O4@G6P微球,并将其作为新型亲水性探针,成功地选择性富集了复杂生物样品(人血清和人唾液)中的N-糖肽,实验结果表明,该材料对于糖肽具有优异的富集性能,灵敏度高(0.5 fmol/μL),选择性高(horseradish peroxidase (HRP)∶BSA=1∶100, m/m),重复性好(至少10倍),在基于MS策略的糖肽富集中有很好的应用前景。王富强等[47]通过将硼酸分子共价结合到硅烷化的Fe3O4@mTiO2微球表面上,制备得到了硼酸修饰的磁性Fe3O4@mTiO2微球,该材料B-Fe3O4@mTiO2同时具有超顺磁性和介孔。而且为了提高材料的富集效率和使用效率,研究人员开发了一种将B-Fe3O4@mTiO2与聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)纳米珠一起使用的协同方法,用于高度特异性和有效地富集N-糖肽/糖蛋白。富集糖肽结果表明,与单独应用B-Fe3O4@mTiO2相比,协同方法可以检测到更多数量的糖肽,信噪比显著增加,灵敏度大大提高,而且测定糖肽的回收率高达92.1%。

金属有机骨架(metal organic frameworks, MOFs)材料,也称多孔配位聚合物,是一类以金属离子为中心、有机物为配体的新型多孔骨架材料,由于具有多孔性、较大的比表面积、可设计的结构、可调的孔径等优点,使得MOFs在糖肽的富集应用中有独特的优势[48]。基于此,张祥民等[49]利用外延生长策略成功制备了Fe3O4@Mg-MOF-74核-壳纳米粒子,该材料具有一维通道结构、合适的孔径、亲水性和生物相容性等优点。使用该纳米粒子进行富集后,在1 μL消化的人血清中,对应于125种糖蛋白和18种糖肽的441个N-糖基化位点可以被成功检测到,证明材料具有高的富集效率和选择性。白玉等[50]通过简单常规的两步方法合成了半胱氨酸功能化的金属有机骨架,先将Au纳米颗粒原位加载到氨基衍生的MOF上,然后再进行L-半胱氨酸固定。由于该纳米复合材料具有较大的比表面积和超高亲水性,在模型糖蛋白和Hela细胞裂解物中富集N-糖肽时表现优异。而且通过使用这种复合材料,从细胞裂解物中可以鉴定出对应于1 069个N-糖肽和614个N-糖蛋白的1 123个N-糖基化位点。结果证明,半胱氨酸功能化的金属有机骨架材料结合能力大(150 mg/g, IgG消化至材料)、选择性良好(IgG和BSA消化的摩尔比为1∶50)、回收率高(超过80%)和检测限低(1 fmol),在糖肽富集中有很好的应用前景。

共价有机骨架材料(covalent organic frameworks, COFs)是由有机结构单元通过共价键形成微孔/介孔结构的一类新型高分子材料,由于具有大的比表面积、极低的骨架密度、可调的孔结构、良好的酸碱稳定性和热稳定性等显著优点,被广泛应用于糖肽富集中[51]。钱小红等[52]通过溶剂热反应,在磁性纳米粒子表面上原位生长TpPa-1共价有机骨架,构建具有超顺磁性的海胆型复合材料Fe3O4@TpPa-1,将该材料用于亲水富集时,可以分别从IgG和HRP消化物中检测到37种和22种糖肽,可以从人血清消化物中检测到对应于114种糖蛋白的228种糖肽,证明了这种新材料的富集效率高,检测限低(28 fmol),在糖蛋白组学研究中有很好的应用。马玉芳等[53]利用1,3,5-三甲基间苯三酚和对苯二胺的席夫碱反应合成TpPa-1共价有机骨架材料,并将其成功地用作N-糖肽富集的亲水性多孔材料。这种材料对糖肽有很好的特异性和选择性,可以有效消除非糖肽的干扰,有利于进行糖肽的质谱检测。而且由于材料中具有强的共价键,该材料具有良好的稳定性,可以重复使用至少10次,在N-糖肽富集中有良好的应用前景。这些功能材料的成功应用进一步表明其在蛋白质组学研究中的应用潜力。

4 功能材料在蛋白质组定量研究中的应用

18O标记是目前广泛应用的一种蛋白质定量标记方法,18O标记方法具有操作简单、无副产物、条件温和等优势,但是也存在标记不完全、效率低、18O和16O发生反向交换、标记易丢失等问题[54]。为了解决这些问题,研究人员开始研究能在定量中辅助18O标记设计的功能材料。钱小红等[55]将毛发状非交联聚合物链杂化磁性纳米粒子作为基质,利用原子转移自由基聚合技术,开发了一种新型的固定化胰蛋白酶,用于实现简单快速的18O标记和蛋白质组定量。在他们的标记策略中,游离胰蛋白酶被PHMN-胰蛋白酶替代,其在标记仅1 min后就可以通过磁体方便地与标记的肽分离,实验结果表明,两种标准参考肽ENO-1和ENO-2具有两个18O原子的完全标记,在3次试验中的平均标记效率分别为96.7%和96.5%,并且未发生18O和16O的反向交换,该固定化胰蛋白酶成功实现了简单快速的18O标记。这表明功能材料也可在定量蛋白质组研究中发挥作用。

5 结束语

对于功能材料在蛋白质组学中的应用的研究从未停止,由早期的单一材料发展到复合材料,从直接使用自然界中的已有材料到对已有材料进行改性和使用新型材料来有效提高蛋白质组的分析效率,改善分析方法选择性、灵敏度和易操作性。尽管如此,为了功能材料能在蛋白质组学研究中发挥更好的作用,对功能材料的选择应用,还需要综合考虑多方面因素,包括功能材料的来源难易程度、理化性质、工艺成本和可修饰特点等。另外,随着材料学和生物工程技术的发展,更多性能优良的功能材料将不断被应用到蛋白质组学研究中,这不仅扩展了功能材料的应用范围,也必将满足蛋白质组学不断提出的新挑战、新问题,促进蛋白质组学研究迈向更高层次。