推拿对兔腰椎间盘退变组织中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的影响*

赵小艳， 苏程果，刘华辉，罗才贵，袁 晔，朱明双△

1.成都中医药大学附属医院(成都 610075)；2.四川宝石花医院 (成都 610213)

椎间盘退变是大多腰腿痛患者的共同病理基础，已造成严重的社会经济负担[1-2]。国内外已有椎间盘退变性疾病的发病机理及治疗方法的相关研究[3-5]。研究[5]表明，推拿对椎间盘退变性疾病有着良好的临床疗效，而TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF与腰椎间盘退行性变关系密切。本研究观察推拿对兔腰椎间盘退变组织中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF含量的变化，进一步证实推拿对腰椎间盘退变性疾病的防治作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4月龄新西兰大白兔33只，体重2.0～2.5 kg，由成都达硕实验动物有限公司提供，实验动物许可证号: SCXK(川) 2018-17。实验于成都中医药大学实验动物中心完成，此次研究符合动物伦理学标准。

1.2 主要实验试剂及设备

ELISA试剂盒(MLBIO)；二甲苯(国药集团)；无水乙醇(国药集团)；乙二胺四乙酸二钠(上海凌风)；氢氧化钠(沪试)；新型脱钙液(北京索莱宝)；超声细胞粉碎机(宁波新芝生物)；台式高速冷冻离心机(Heal Force)；全自动研磨仪(servbio生物 )；脱水机 (武汉俊杰) 等。

1.3 造模分组

白兔适应性喂养1周后，先取3只动物进行造模预实验。随机从中取1只通过耳缘静脉空气栓塞后解剖其腰椎组织，观察兔腰椎解剖结构。然后取2只借鉴黄杰烽等[6]的穿刺纤维环法进行兔腰椎间盘退变造模预实验，然后处死，解剖观察到穿刺针刺入椎间盘。剩余30只白兔随机分成空白组、模型组、推拿组，每组10只。除空白组外其他两组均进行兔腰椎间盘退变造模，具体方法如下。造模前24 h禁食，称重并计算麻醉剂量，10%的水合氯醛按3 mL/kg进行耳缘静脉注射麻醉。定位: 将动物俯卧位放置固定、备皮、消毒。在兔最下端肋骨对应椎体的下一个椎体棘突即为L1棘突，髂棘高点平对L6椎体，依次标记各段腰椎。左手拇指定位 L5、L6横突末端连线中点，右手持针在左手定位点上方约1 cm处与地面水平缓慢进针，破皮后针向头侧略倾斜20°，该点约平对L4-5椎间盘，即可穿刺到具有韧感的组织，若穿刺针下为坚硬的骨性物，此时可向兔子头侧或尾侧轻微调整即可穿刺到具有韧感的椎间盘，穿刺深度约5 mm，停留时间5 s。再依法穿刺L3-4、L5-6椎间盘，左右各穿刺1次。术后连续 3 d肌注青霉素40万U/只。

1.4 推拿

造模后第2天，对推拿组实验动物进行为期6周的推拿干预，空白组和模型组不予特殊处理，正常喂养。推拿手法参照成人推拿的临床经验手法，具体方法如下：1)从上往下按揉脊柱两侧膀胱经，侧重腰骶部分，约5 min， 操作缓慢渗透，以力透双侧竖脊肌深层；2)点按双侧膀胱经肾俞、大肠俞、秩边、环跳，约2 min；3)顺膀胱经弹拨脊柱两侧竖脊肌，约3 min。以上手法的轻重频率均由专人经训练后操作。治疗 1 次/d， 10 min/次。

1.5 标本采集

6 周后，从实验动物耳缘静脉空气栓塞处死后，截取第L3至L6腰椎及其间的椎间盘组织，然后每组随机选10个椎间盘放入-80°冰箱保存；另外每组随机选6个椎间盘放入体积分数4%甲醛溶液中固定24 h，预备做石蜡切片。

1.6 观察与检测

1.6.1 动物反映综合评分 实验动物分别于造模后第1天、第1周、第3周、第6周，依据其精神情况、进食量、运动量及对外界刺激的反应4项进行评估，参照黑龙等[7]实验动物综合反映评分，具体如下：每项正常2分，良好1分，很差0分。总分8分为正常。

1.6.2 苏木精-伊红(HE)染色检测椎间盘组织形态学变化 标本24 h固定后，然后用新型脱钙液脱钙2个月，脱钙液更换周期为2～3 d，然后依次梯度酒精进行脱水与石蜡包埋，再以4 μm厚度切片，每个椎间盘标本挑选2片切片，在光镜下观察椎间盘组织形态学变化，根据Han等[8-9]的椎间盘退变组织学评估表评价椎间盘退变程度。从髓核形状和大小、髓核中细胞和基质构成、纤维环形状、纤维环中细胞的基质构成、纤维环和髓核的分界5项进行评分，每项正常计1分，轻度不规则计2分，重度不规则计3分。总分5分为正常，15分为严重退变。

1.6.3 酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测椎间盘中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的含量 提取出冰冻的椎间盘组织，用9倍匀浆介质研磨。将研磨液以3 000 r/min，离心半径5.5 cm，离心10 min，取上清液制作成10%的组织匀浆。然后进行BCA定量，配制适量BCA工作液和标准蛋白溶液，并以蒸馏水作为空白对照，再采用微孔板法计算样品的蛋白浓度。然后根据说明书步骤采用ELISA法检测椎间盘组织中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的含量。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 腰椎间盘退变造模解剖结果

白兔腰椎间盘退变造模解剖后，显示L3至L6的椎间盘为乳白色的圆柱体，并逐渐增大，位于横突前上方。且椎间盘为韧性较强的结构，穿刺到椎间盘时指下可感到滞涩沉紧感。椎间盘造模解剖图如下(图1)。

图1 造模解剖图

2.2 动物反映综合评分

各测试时间点动物反映综合反映评分的整体差异有统计学意义(P<0.05)；测试时间与动物综合反映评分的交互作用的整体差异有统计学意义(P<0.05)；组间比较整体差异有统计学意义(P<0.05)(表 1)。

表1 各组实验动物综合反映评分(分，

注：数据采用重复测量方差分析，球形检验P<0.05；多变量检验中各测试时间点P<0.05，测试时间*动物综合反映评分P<0.05；LSD组间两两比较P<0.05

2.3 各组椎间盘组织形态学评分

空白组显示：椎间盘中分布大小一致的圆形髓核细胞，细胞间基质丰富紧密，髓核与纤维环分界清楚，纤维环结构完整，排列清晰。模型组显示:髓核细胞分布多不均匀，较多髓核细胞胞质疏松或呈空泡状，排列紊乱，胞核较少；局部纤维环结构可出现紊乱，排列疏松不规则；纤维环和髓核界限多不清晰。推拿组显示:髓核细胞分布稍均匀，较多髓核细胞胞质疏松或呈空泡状，胞核减少；周围纤维环可有紊乱；髓核与纤维环分界较不清晰。相比空白组的组织形态学评分(5.17±0.41)，模型组的组织形态学评分(10.33±2.07)和推拿组的组织形态学评分(9.00±3.46)均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。推拿组的组织形态学评分略低于模型组，差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。

图2 椎间盘组织形态学(HE,×200)

注：A、B：空白组；C、D：模型组；E、F：推拿组

2.4 各组椎间盘组织中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF表达比较

模型组TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF表达均高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明穿刺椎间盘纤维环的方法促进了白兔腰椎间盘TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的表达；推拿组TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF 表达均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明推拿可降低白兔椎间盘组织中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的表达(表2)。

表2 椎间盘中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF表达比较

注:对比空白组，aP<0.05；对比模型组，bP<0.05

3 讨论

细胞因子所诱发的炎症反应被视为导致椎间盘退变的因素之一，退变椎间盘中的髓核细胞可分泌IL-6、TNF-a等众多炎症因子,并对其产生反应[10]。IL-6为炎症促进因子，可刺激炎症细胞聚集，破坏蛋白聚糖Ⅱ型胶原的比例，促使髓核中水分丢失，从而加速椎间盘退变[11]。董振辉等[12]发现，外源性 IL-6 可通过P38MAPK 和P- JNK/SAPK 信号转导途径诱导退变髓核细胞凋亡。而TNF-α 亦叫做恶质素，为重要的炎性因子[13]。TNF-α主要由单核细胞、巨噬细胞产生，具有多种生物学活性，可促使血管扩张、白细胞趋化，从而增多吞噬细胞，释放内毒素，进而加重炎症反应，TNF-α的分泌量体现了炎症程度[14]。TNF-α 不仅可活化巨噬细胞，且可与多种细胞因子( 如 IL-1，IL-6，IL-8 等) 相互作用，进而参加各种免疫反应[15]。且TNF-α与神经功能有关，可能在神经损伤中起主导作用[16]。研究[16-18]表明，IL-6、TNF-α 与椎间盘退变密切相关，其表达水平与椎间盘退变呈正相关趋势。本研究结果则显示，模型组、推拿组椎间盘组织中 IL-6、TNF-α的分泌量明显高于空白组，推测IL-6、TNF-α参与椎间盘的退变；且推拿组分泌量明显低于模型组，推测推拿可通过减少IL-6、TNF-α的分泌量而缓解椎间盘退变。

TGF-β1为转化生长因子, 可调节细胞的生长和分化。且研究[19]显示，TGF-β1 在退变椎间盘组织的表达明显升高。而TGF-β1的表达量和腰椎间盘退行性病变的病情严重程度呈正相关[20]。Tran等[21]证实， TGF -β1 通过 Smad3/AP-1 通路调节椎间盘髓核内 CTGF 的表达，且退变椎间盘中的 CTGF 含量比正常者高。有研究[22]显示，软骨细胞中CTGF可促进蛋白多糖、Ⅱ型胶原的表达，并促进细胞基质合成并抑制凋亡。且研究[23]证实，腰椎间盘中TGF-β1及TNF-α、IL-6等炎性细胞因子水平随着病情加重呈显著增高趋势，TGF-β1与TNF-α、IL-6等炎性细胞因子均呈显著正相关，同时TGF-β1与椎间盘退变程度呈显著正相关。本研究结果显示，模型组、推拿组椎间盘组织中TGF-β1、CTCF的分泌量明显高于空白组，推测 TGF-β1、CTGF参与椎间盘的退变；且推拿组分泌量明显低于模型组，推测推拿组腰椎间盘退变程度低于模型组。

综上所述，本研究证实了TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF与腰椎间盘退变密切相关，且推拿组TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的分泌量均降低，推测推拿可减缓腰椎间盘退变，且TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的分泌量可能与椎间盘退变程度呈正相关。而推拿作用机理可能与抑制炎症反应，降低TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF含量相关。上述因子的检测对推拿治疗腰椎间盘退行性疾病有着重要的意义，但细胞因子间的相互作用对腰椎间盘退变的影响仍需进一步研究。