LncRNA SNHG1对非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭的影响研究*

邓仕华，胡章勇，吴东明，刘 腾，许 颖

成都医学院第一附属医院 检验科(成都 610500)

肺癌作为最常见的恶性肿瘤之一，发病率、病死率都高居所有恶性肿瘤之首，分别占11.6%和18.4%[1]。临床上肺癌又分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌，其中NSCLC约占85%。目前，尽管临床上对肺癌的治疗已经取得了十足的进展，但肺癌的预后仍不如人意。肺癌早期临床症状不明显，导致肺癌患者预后不良的主要原因是肺癌晚期时肿瘤细胞转移，且缺乏有效的治疗措施。

目前关于肺癌转移的具体分子机制尚未完全阐明。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤细胞发生转移的主要过程之一，常常受到多种基因的调节。在正常组织中，EMT与器官的发育、形成、组织的重塑和伤口的愈合有关。在肿瘤细胞发生EMT的过程中，极化的、迁移能力差的上皮细胞获得高度恶性细胞的特征，特别是运动性、侵袭性和传播能力[2]。EMT促进肿瘤迁移和侵袭的作用是基于间质标志物的富集(如N-cadherin)和上皮细胞标志物的减少(如E-cadherin)[3]而实现。近年研究[4-5]表明，长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)与包括肺癌在内的多种肿瘤的发生发展密切相关。核仁小分子RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1)是一个LncRNA，在人体组织中广泛表达，与多种肿瘤的发生发展均有一定关系。已有研究[6-7]表明，SNHG1可通过调控微小RNA(microRNA)而间接促进肺癌细胞的恶性化进展，但具体机制仍未有统一定论。因此，本研究在此基础上， 进一步探讨 SNHG1 在NSCLC细胞迁移和侵袭和中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺腺癌细胞系A549及SPC-A1为本课题组保存。用于蛋白质印迹法相关一抗：β-actin；E-cadherin，N-cadherin，Vimentin及二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司(中国Proteintech公司)。本实验所用的细胞培养皿、6孔板、24孔板、transwell小室等均购自康宁公司。qRT-PCR所用RNA提取试剂盒购于北京索莱宝生物公司。逆转录及扩增试剂盒购于美国Bio-rad公司。ECL显影液购于美国Millipore公司，化学发光成像仪购于美国Bio-rad公司。细胞培养用小牛血清购于中国Cell max公司，青-链霉素购于美国Gbico公司；RPMI-1640培养基、0.25%胰酶购于美国hyclone公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 A549及SPC-A1细胞用含有10%的小牛血清及双抗(100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的链霉素)的RPMI-1640培养基培养于37 ℃，5%CO2培养箱，待细胞密度达到约80%时，0.25%胰蛋白酶消化细胞，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞转染 过表达质粒由上海吉满生物公司构建并合成，干扰套装由广州锐博生物公司设计提供。转染前接种2×105个细胞于6孔板中，待细胞生长到80%时弃去原有培养基，更换为无血清新鲜培养基，1 750 μL/孔，取两支1.5 mL EP管，分别加入125 μL无血清培养基再分别加入Lipo 3000 5 μL充分混匀。另取两支1.5 mL EP管，分别加入125 μL 无血清培养基再分别添加SNHG1质粒或者干扰序列2 μg，充分混匀后分别加入4 μL P3000(干扰序列不加)再次混匀。将用稀释的质粒或干扰序列分别加入到已稀释的Lipo 3000中，充分混匀后室温静置5 min。最后将250 μL混合液分别加入到6孔板中，37 ℃CO2培养箱中培养。5 h后更换含10%小牛血清的新鲜培养基，常规培养。根据需要收集细胞进行实验。

1.2.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 采用索莱宝总RNA提取试剂盒进行RNA的提取；Bio-rad逆转录试剂盒进行逆转录；利用Bio-rad的 SYBR-Green PCR Mix试剂盒检测 SNHG1 mRNA 表达水平。β-actin 作为内参，采用 2-ΔΔCt公式对SNHG1基因表达进行相关计算。每组试验重复 3 次。

1.2.4 蛋白质印迹法 RIPA裂解细胞，BCA试剂盒(上海碧云天)检测蛋白浓度，取60 μg蛋白用于上样，用10%的SDS page胶跑电泳(浓缩胶80 V，分离胶120 V)，0.2 μmol/L的PVDF膜(美国Millipore)100 V转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜。次日TBST洗10 min 3次，加入二抗(1∶10 000)室温孵育2 h，TBST洗10 min 3次，ECL显影液显影，化学发光成像系统进行成像。实验重复3 次。

1.2.5 划痕实验 每6孔板孔中加10×104个各实验组细胞，待细胞融合90%左右时用200 μL枪头垂直6孔板划横线，生理盐水洗3次，无血清培养基继续培养24 h，按0、24 h的时间点拍照。实验重复3次。

1.2.6 transwell迁移及侵袭实验 2×104个细胞加入含有200 μL无血清的培养基的transwell小室(小孔直径8 μm)，24孔板孔中加入含有10%小牛血清的培养基600 μL，将transwell小室置于24孔板中，常规培养24 h。取出小室，PBS洗3次，用含1%的结晶紫染色15 min，PBS洗3次，用棉签擦去小室上层细胞，取下底膜，用中性树胶封片，高倍镜下计数5个视野，取平均值，以检测细胞的迁移能力。细胞侵袭实验与迁移大致相同，只是在加入细胞前有铺基质胶的过程：基质胶matrigel 4 ℃解冻，按无血清培养基：matrigel=7∶1的比例混匀作为基质胶层，每小室加入50 μL，待胶凝固(37 ℃ 1 h左右)，之后按迁移的步骤进行后续实验。实验重复3次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 SNHG1在肺癌中存在高表达且与患者总生存期呈负相关

利用GEO数据库数据集(GSE19804,GSE19188,GSE74706) 资料分析发现，SNHG1在肺癌组织中明显高表达；在肺癌患者中SNHG1的表达量与总生存期存在负相关(GSE30219，P<0.001; GSE19188,P=0.034; GSE37745,P=0.011)(图1)。

图1 SNHG1在肺癌中存在高表达且与患者总生存期呈负相关

注：A：3个GEO数据集分析显示，SNHG1在肿瘤组织中的表达均高于正常组织，差异均有统计学意义，P<0.001；B：3个GEO数据集分析显示，SNHG1的表达与患者的总生存期呈负相关

2.2 过表达SNHG1促进NSCLC细胞迁移、侵袭及EMT

采用 qRT-PCR方法对SNHG1的过表达效率进行了验证,结果显示A549细胞及SPC-A1细胞均发生了明显的过表达，细胞划痕结果显示，划痕愈合率A549过表达组为(73.67±6.50)%，对照组为(43.00±5.56)%，P=0.003；SPC-A1过表组为(63.67±5.51)%对照组为(43.31±6.96)%，P=0.012；transwell迁移实验结果显示，迁移细胞数A549过表达组为61.67±5.68，对照组为37.33±8.02，P=0.012；SPC-A1过表组为71.33±5.13对照组为43.33±7.02，P=0.005。划痕及迁移实验均表明，SNHG1明显促进了NSCLC细胞迁移；transwell侵袭实验表明，SNHG1明显提高了NSCLC细胞的侵袭能力(A549细胞侵袭数量为过表达组为46.00±7.50，对照组为29.00±5.65；P=0.035；SPC-A1过表组为75.00±8.00对照组为44.61±8.50，P=0.011)。利用蛋白质印迹法检测过表达SNHG1及对照组NSCLC细胞的上皮及间质标志物，结果表明，与空载组相比，过表达SNHG1的细胞上皮标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达明显减少，而间质标志蛋白N-钙黏蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(vimentin)明显增加，提示过表达SNHG1后肿瘤细胞发生了明显的EMT(图2)。

图2 过表达SNHG1促进NSCLC细胞迁移、侵袭及EMT

注：A: qRT-PCR检测过表达质粒SNHG1在A549及SPC-A1两种NSCLC细胞中的表达效率，与空载组相比，***P<0.001；B、C：划痕实验检测过表达SNHG1对NSCLC细胞迁移的影响，B：光镜图片，标尺:500 m；C：统计图，与空载组相比，*P<0.05，**P<0.001；D、E：transwell迁移实验检测过表达SNHG1对NSCLC细胞迁移的影响；D：结晶紫染色光镜图片，标尺:50 m；E：统计图，与空载组相比，*P<0.05，**P<0.001；F、G：transwell侵袭实验检测过表达SNHG1对NSCLC细胞侵袭能力的影响，F：结晶紫染色光镜图片，标尺:50 μm；G：统计图，与空载组相比，*P<0.05；H：蛋白质印迹法检测过表达SNHG1对NSCLC细胞EMT的影响

2.3 干扰 SNHG1抑制NSCLC细胞迁移、侵袭及EMT

为了进一步验证SNHG1在NSCLC细胞迁移、侵袭及EMT中的作用，本研究设计了SNHG1的干扰序列，利用qRT-PCR对SNHG1的干扰效率进行了验证，同时细胞划痕[A549对照组愈合率为(43.32±9.07)%，干扰组为(22.00±3.61)%，P=0.019；SPC-A1对照组为(42.89±7.40)%，干扰组为(15.00±5.00)%，P=0.005]、transwell迁移(A549对照迁移数量为45.67±7.02，干扰组为29.00±5.00，P=0.028；SPC-A1对照组为35.67±7.63，干扰组为18.67±5.50，P=0.035)及侵袭(A549对照侵袭数量为40.00±5.00，干扰组为23.67±4.50，P=0.013；SPC-A1对照组为45.33±7.09，干扰组为26.67±5.68，P=0.023)实验结果显示：与对照组相比SNHG1干扰的NSCLC细胞迁移及侵袭能力明显减弱。蛋白质印迹法检测结果也证实干扰 SNHG1可明显抑制NSCLC细胞EMT的发生(图3)。

图3 干扰 SNHG1抑制NSCLC细胞迁移、侵袭及EMT

注：A: qRT-PCR检测SNHG1干扰序列在A549及SPC-A1两种NSCLC细胞中的干扰效率，与对照组相比，**P<0.01；B、C：划痕实验检测干扰SNHG1对NSCLC细胞迁移的影响;B：光镜图片，标尺:500 μm；C：统计图，与空载组相比，**P<0.001；D、E：transwell迁移实验检测干扰SNHG1对NSCLC细胞迁移的影响；D：结晶紫染色光镜图片，标尺:50 μm；E：统计图，与空载组相比，*P<0.05；F、G：transwell侵袭实验检测干扰SNHG1对NSCLC细胞侵袭能力的影响；F：结晶紫染色光镜图片，标尺:50 μm；G：统计图，与空载组相比，*P<0.05；H：蛋白质印迹法检测干扰SNHG1对NSCLC细胞EMT的影响

3 讨论

肺癌是人类癌症相关死亡的主要原因，2018年全球新发肺癌病例约209万，死亡病例数约达176万[1]。虽然当前肺癌的手术治疗、放化疗等主要方法不断取得新的进展，但肿瘤转移仍然是肺癌患者预后不良的主要原因，总体5年生存率仍较低[8]。因此，探索新的肿瘤转移相关基因并研究其影响肿瘤发生发展的机制显得尤为重要。

近年研究[9-10]表明，LncRNA不仅可通过调节染色质重构、组蛋白修饰、DNA甲基化等多种途径而转录激活或干扰多种重要生命活动，还与肿瘤的发生发展密切相关。有研究[11]表明，异常表达的LncRNA在调控肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭等恶性生物学进程中扮演着重要作用，LncRNA有望成为肿瘤治疗的新靶点。SNHG1位于11号染色体的1区2带上，其长度为1 134 bp[12]。近年研究表明，异常表达的SNHG1可通过负性调控多种miRNA而促进食管癌[13]、肝癌[14]、肺癌[15]等肿瘤的恶性化进展，另一方面SNHG1也可直接作用于肿瘤相关信号通路调控胰腺癌、结肠癌、食管癌等肿瘤的发生发展。而关于SNHG1在肺癌中的作用及具体的作用机制尚无统一定论，仍需进一步研究。本研究利用公共数据库资料证实， SNHG1在肺癌组织中高表达，并分析了SNHG1的表达与肺癌患者的总生存期呈现负相关。并通过在两种NSCLC细胞中过表达以及干扰SNHG1后，检测NSCLC细胞的迁移、侵袭能力以及EMT的发生情况。

综上所述，SNHG1可能通过促进NSCLC细胞发生EMT而增加其迁移和侵袭能力，由此推断SNHG1可能成为NSCLC治疗的新靶点。