氧化石墨烯作为药物载体的研究进展

胡玉婷，李培源

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

英国曼彻斯特大学Andre Germ等人的研究团队通过简易的机械剥离法初次获得了具有二维晶体构造的单层六元环石墨烯(graphene)。石墨烯具有独特且优异的光学、力学、电学性能[1]及特殊的含氧结构，使其在能源材料、导体材料、电子设备等领域有着广泛的应用，但石墨烯也存在着亲水性差等缺点，限制了其在某些领域上的发展。在众多学者的不断探索下，发现了石墨烯的衍生物氧化石墨烯(graphene oxide，GO)，氧化石墨烯具有亲水性强、比表面积大、生物相容性好等优异的特性，若对其进行功能化地修饰，可以达到高效载药的目的，使其在生物医学领域上有进一步的发展。

1 氧化石墨烯的性质

1.1 石墨烯的性质

石墨烯中的碳原子杂化轨道为 sp2，是具有六元环状的二维碳基纳米材料[2]，厚度仅有0.335 nm，在二维材料中是最薄的，石墨烯可以通过机械剥离法、化学合成法、化学气相沉淀法制备，这些方法各具优劣，故在制备方法上，有待进一步地改善。石墨烯具备稳定的化学性质及催化作用，独特的二维结构使其复合材料在催化、电池、传感器等领域表现出优良的性能，是极佳的电极修饰材料[3]。但其强疏水性限制了医药领域方面的应用，需对其进行改性或者一些化合物的接枝来进一步扩展应用范围。

1.2 氧化石墨烯的性质

氧化石墨烯是石墨烯的含氧衍生物，故在某方面与石墨烯相似，比如碳原子结构同为层状平面二维，而差异则在于GO表面含有羟基、羧基、羰基等丰富的含氧基团，故厚度大于石墨烯。氧化石墨烯具有两亲性，中间片层(环氧基、羟基)呈疏水性，边缘(羧基、羰基)呈亲水性，前者可通过π-π堆积或疏水作用负载一些疏水性物质，后者可以为其功能化修饰提供位点，容易对其进行表面修饰，为与其他基团的结合提供了可能，令其进一步作为载体在体内更好地发挥作用提供了基础。GO因含有较多含氧基团故层与层之间通常带负电荷，易与带正电的基团相结合，使片层间距增大。关于氧化石墨烯的制取方法目前有Brodie法[4]、Staudenmaier法[5]、Hummers法[6]三种较为大众认可。Brodie法制备效率低，且工序复杂、对环境污染较大,Staudenmaier法制备出的GO含氧量较前者提高但制备的效率依旧太低，而Hummers法是一种简单高效的制备方法，通过大量科研人员对Hummers法进行改良，使此法成为当今较为普遍的制备GO的方法。

2 氧化石墨烯的功能化修饰

氧化石墨烯表面具有丰富的含氧基团，可通过疏水作用、氢键等作用吸附药物和其他大分子[7]。这使得其在生物医学领域具有广泛的应用，GO在体内的血液相容性和分散性可以通过改变其尺寸或性质得到优化，经过修饰的GO可以拥有较低的毒性，良好的靶向性和缓释性，易通过代谢排出，缩减对正常组织代谢的不良反应，从而减少对有效物质的浪费。目前修饰方法大多分为共价修饰和非共价修饰两种类型。

2.1 GO的共价修饰

GO的共价修饰多应用其表面丰富的含氧基团，与多种亲水性较强的分子通过共价键接枝完成功能化修饰，目前多用壳聚糖(CS)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺(PEI)与GO表面的含氧官能团进行反应，可以使GO的稳定性及生物相容性得到进一步提升。马文石等[8]在温和条件下将乙醇胺与GO进行反应，经水合肼还原，经反应形成酯键和酰胺键从而获得乙醇胺化的氧化石墨烯，干燥后再由超声处理，产物能稳定分散于水、乙醇等溶剂中，乙醇胺的加入使GO在介质中的再分散性升高。孙彤等[9]制备羧基化的GO，用PEG- NH2对GO进行修饰，通过化学物理表征，证实GO-CONH-PEG在水、机体环境中可以稳定存在，且细胞毒性小。GO的共价修饰是通过化学反应实现的，但化学反应的程度难以得到控制，对GO的修饰及应用产生了阻碍。对成功的案例分析可以发现试剂和官能团活性的差异使发生化学反应的程度不同，不同的官能团应选择不同的试剂对其进行修饰，GO表面的环氧基易于亲核试剂发生取代反应而开环[10]。石墨烯边缘的羧基反应活性较高，故多以此基团用于改性，除此之外，环氧基和羟基也可以用于修饰。Wang等[11]人将丙基胺接枝到GO表面，大大增加了GO的水溶性和稳定性。Shan等[12]人在GO表面连接赖氨酸(PLL)，使GO拥有更多优异的功能。

2.2 GO的非共价修饰

关于GO的非共价修饰，更多的是利用GO层间与分子化合物之间的非共价作用力，例如π-π堆积、氢键、范德华力等对化合物进行物理吸附。此方法不仅保持了GO的结构稳定，还避免了对含氧基团的改性，故在某些应用方面非共价修饰更占优势。GO的非共价修饰法主要包括包裹聚合物、吸附生物大分子化合物等，比如蛋白质、DNA等，均可以提高GO的稳定性，减少细胞毒性，提高安全性[13]。崔欣等[14]利用疏水性质以及π-π堆积在GO表面连接DNA适配体，构建了GO的碳点标记DNA适配体Hg+生物传感器。虽然非共价修饰能为GO提供一些新的特性，但此修饰方法不够稳定，外界的改变对其影响颇大，故对此修饰方法的改性有待进一步探索。

2.3 GO的其他修饰

磁性纳米材料因拥有超顺磁性、高矫顽力和比饱和磁强度高等优良性质，使其成为生物医学范畴研究的焦点，其中磁性四氧化三铁(Fe3O4)粒子的应用较为广泛。王俊梅[15]利用一步水热合成法，制成了磁性Fe3O4通过表面改性后与GO结合获得磁性微球/GO复合材料，通过对抗癌药物5- FU的转载，在不同 pH条件下释放行为发现中空复合微球仍具有明显的超顺磁性。磁性GO还可以对中药中难溶物质进行装载后的高效利用，赵志娜[16]通过化学共沉淀法制备出磁性GO纳米颗粒( Magnetic Graphene Oxide,MGO)，将其成功载入姜黄素(CUR)纳米粒，制备CUR- MGO，对其进行物化表征后发现复合纳米粒载药量达到4.61%，药物导入成功，在体外释放测试中表明其释放功能受细胞环境pH影响，在酸性条件下释放较快。沈俊海[17]等通过氧化超声剥离法制备出GO后通过化学共沉淀与Fe3O4复合，获得一组质量比及组分不同的GO-Fe3O4复合物，通过表征及微观构象的观察，并负载阿霉素(DOX)进行正交试验，结果表明温度及DOX浓度及溶液pH均影响药物的释放，且具有pH依赖性。

3 氧化石墨烯作为药物载体的研究

现今已有包合物、纳米乳、微球等多类型药物载体都可增加药物溶解度、延长药物的血液循环[18]，但由于载药率低，难以对病灶部位进行高浓度、高靶向性给药，因此，研发新型载药材料成为不可避免的新趋势。GO作为一种新型的药物载体，以其优异的载药性和负载率、病灶靶向给药等方面受到诸多关注。氧化石墨烯的水溶性虽然比石墨烯高，但是其存在在盐溶液及生理条件下容易聚集的情况，为了改善体内的不稳定性，学者们对其也进行了多样化的修饰。且如何在负载的药物释放后，清除GO载体在体内产生的毒性，也是当今必须重视的问题。

3.1 GO载药性能的研究

3.1.1 化学合成药物的负载

当今的诸多药物均存在水溶性及靶向性较差等问题，使药物在体内的吸收减弱或难以到达病灶部位，若利用GO的生物相容性及溶解性等特性对药物进行负载，可有效提高诸多药物的药效。杨琳等[19]通过动物实验对比GO载入5- FU后的复合粒与5- FU本身杀灭致癌因子的能力，发现在药物含量相同的条件下GO-5-FU杀灭乳腺癌4T1细胞的能力远高于5- FU本身，说明GO具有对药物的高负载率及靶向给药功能。张龙姣等[20]先用叶酸对GO进行修饰，而后负载多柔比星，置于pH值为5的磷酸缓冲液中，在温度恒定在37℃条件下观察药物的体外释放，定时定量取反应时间间隔相同的反应物进行紫外分光光度法测定释放量，结果显示在释放时长为157 h时，药物累计释放量为44.85%，与释放时间呈正相关且具有缓释性。Liu Z等[21]研究聚乙二醇修饰GO即NGO- PEG(简称NG-O)，作为纳米载体，通过非共价键作用装载难溶性抗癌药物，NGO吸附SN38(喜树碱)在机体环境下具有优异的生物相容性和稳定性，并且提高了SN38的水溶性，发现在体外实验中对癌细胞HCT-116具有更高杀灭力。

3.1.2 传统中药的负载

中药里含有多种生物活性物质，如黄酮类、多酚类物质等，含有较好的抗菌及抗氧化等优异的性能，但其水生物利用率低、在体内不稳定、水溶性差，若将其与GO制成复合纳米材料，可以提高不溶于水的有效成分溶出，协助其药物直达病处[22]，GO的抗菌性能在抗菌药物领域具有宽阔的应用市场，与中药的清热解毒、镇痛消炎等疗效类似[23]。仇云兵等[24]将金丝桃素通过π-π堆积和氢键作用接枝到GO上，所获得的产物具有良好的稳定性并可提高金丝桃素的光敏性和吸附量。徐志远等[25]采用PEG- GO对贝壳杉烷二帖类化合物毛萼乙素(eriocalyxin B)进行负载，负载后的毛萼乙素亲水性和在盐溶液中的稳定性得到改良。且负载率达18.8%，通过对癌细胞A549的毒性试验，发现PEG-GO-毛萼乙素对于细胞的杀灭能力远高毛萼乙素本身。李龙剑[26]通过构建搭载芦荟苷-GO水凝胶，对其体外抑菌性能测定、体内皮肤刺激性及疤痕修复考察。结果表明芦荟苷-GO凝胶具有一定的缓释功能，且有良好的抑菌效果，对皮肤没有刺激性，还能促进皮肤血管新生，一定的复原创伤效果。

3.2 GO体内安全性的研究

3.2.1 GO体内毒性研究

随着石墨烯及其衍生物在各大领域的应用，机体对这类材料接触的机会日渐增长，因此，石墨烯材料的安全性不由得引发诸多热议与关注。杨列程[27]利用PEG-GO负载阳离子两亲性药物(CADs)，发现作为药物载体的GO会增加由药物引发的磷脂质病的概率。研究表明GO对细菌具有毒性作用，但细胞若长期接触石墨烯，细胞表面会出现石墨烯聚集，可导致细胞凋亡[28]，使细胞的代谢率与石墨烯浓度呈负相关[29]。Zhang Y等[30]取系列质量浓度差的GO通过尾部静脉注射进小鼠体内，当GO为小剂量时对小鼠无明显毒性影响。当GO剂量达 0.40 mg，小鼠产生慢性毒性反应，其死亡率可达 44.4 %，肺部肉芽肿，GO沉积在各个器官，且无法从肾脏代谢排除。但另一研究发现GO在剂量为20mg/kg的情况下最初积累在肝、脾等脏器，后期又被机体代谢至微量毒性[31]。GO可以刺激线粒体制备活性氧(ROS)，激活炎症及凋亡通路，造成重度肝功能不全，而聚集态和分散态的GO试验的小鼠没有明显的肺损伤[32]。石墨烯及其衍生物的毒性多与材料的直径、剂量浓度、表面形态有关，我们可以通过连接具有特定分散功能的物质来提高GO在体内的分散性和体内外安全性。例如可以使用聚乙二醇(PEG)对GO进行功能化修饰，修饰后的GO具有更好地靶向性，在缓冲液或血液环境中有稳定的分散性，可降低在机体组织的毒副作用，经过PEG修饰的GO可以通过肾脏代谢以尿液形式迅速从体内排出，从而不会引起组织器官的明显毒性[3]。

因此对于GO的毒性而言，不同的给药途径、剂量、实验周期均会对毒性大小产生影响，而且作用机制尚未完全明确，因此我们不能对GO的毒性影响轻易下定论，需要更进一步的探索。

3.2.2 GO尺寸对毒性的影响

血液相容性是对生物医学应用的重要毒性评价，溶血可能导致器官衰竭甚至机体死亡。研究发现GO的血液相容性和体内清除途径与其尺寸大小有关[34-35]，尺寸为纳米级别的GO会较易发生严重的溶血，而尺寸小至微米的GO不易引发溶血，但会易发凝血现象，为了降低溶血能力，需要在尺寸的修改上进一步对其结构进行改造。尺寸差异是GO作为载体在给药系统体内清除途径的决定因素，通常小于10nm的GO能够快速地通过肾脏途径清除[36]，而微米尺寸的GO 则会通过肝脏转移至胆道系统中代谢清除[37]。关于GO的安全性研究虽已有一些结论，但生理系统的多样性使得我们不能轻而易举对其毒性的高低及清除率轻易得出结论，需进一步研究不同尺寸对给药后清除率的影响及其作用机制。

4 结论与展望

氧化石墨烯作为药物载体的应用日益增多，如抗癌药物的负载和靶向治疗、生物成像和光动力治疗[38]，是一种优点众多的载体材料。对于目前GO的应用存在着几个问题，第一是GO多以负载小分子药物研究居多，对于负载如DNA、蛋白质等生物大分子较少。故可以令GO与更多的大分子结合来提高负载物质的多样性。其二是对于GO的各类研究如靶向性与毒性多是在体外进行，缺乏体内实验的数据，可以增加生物体建模的研究，对复合纳米粒的四大体内过程进行探索，其三是石墨烯及其衍生物在机体内长期代谢沉淀的毒性物质仍需进一步研究，与药物分子的相互转化作用也仍需进一步探索[39]。通过解决这些问题可以实现GO的高效载药及可控性，了解GO的作用机制及代谢途径。总之，石墨烯及其衍生物在作为药物载体这项研究中仍存在许多问题，需要各界科研团队的加强学科融合，共同解决面临的困难。