哈维氏弧菌致病因子检测与防治研究进展

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(宁波大学海洋学院,浙江宁波 315211)

近年来,水产品多为集约型养殖,使得养殖水域范围内水质极易恶化,水产品频繁爆发大规模的弧菌疾病。哈维氏弧菌作为其中一种主要致病弧菌,曾引起大量养殖水产品染病甚至死亡[1-5]。哈维氏弧菌为发光的革兰氏阴性弧菌,呈短杆状,长约1～2 μm,极端单鞭毛,可运动,最适宜生长温度为20～35 ℃。在TCBS培养基上培养形成圆形黄色菌落,边缘整齐,直径约为1～1.5 mm[6]。哈维氏弧菌有一定嗜盐性,可以利用葡萄糖,对O/129敏感。对环丙沙星、氯霉素、恩诺沙星、美罗培南、头孢曲松、多西环素、头孢吡肟、诺氟沙星敏感,而对氨苄西林耐受性强[7]。目前关于弧菌的检测多用免疫学检测方法如免疫层析技术[8],酶联免疫技术(ELISA)[9-10],免疫印记技术[9-11]以及与分子生物学方法PCR[12]及LAMP[13-15]法等。由于对其致病机制的研究尚未成熟,目前所了解的与哈维式弧菌致病性的相关因素主要有弧菌本身分泌的胞外产物(ECP)如胞外蛋白酶,溶血素[16]、细胞毒素、铁载体等,除此之外,还有菌群密度感应系统(QS)，也是哈维氏弧菌致病性影响因素之一[17]。并且由于长期使用抗生素类药物抑制弧菌疾病,易导致病原哈维氏弧菌产生耐药性,故现下不适宜用抗生素药物进行抑制,新的抑制弧菌疾病的方法亟待开发。本文对哈维氏弧菌的致病因素、检测技术以及防治研究做一综述,以期为找到诊断及预防该弧菌疾病的技术提供有力帮助[16-17]。

1 哈维氏弧菌致病因素

细菌生长代谢过程种所产生的胞外产物(ECP)对宿主存在极大的毒性作用。胞外产物中主要的致病因子有胞外蛋白酶,溶血素(vhh),铁载体等[18]。

1.1 胞外产物蛋白酶(ECPase)

胞外产物蛋白酶(ECPase)作为哈维氏弧菌胞外产物中的主要毒力因子,表现出很高的丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶活性,且有明显的菌株特异性。哈维氏弧菌通过其自身分泌的胞外酶来干扰宿主机体的平衡,从而引起病原菌在宿主体内繁殖,并随血淋巴运动到宿主全身,破坏宿主的凝血系统酶活性,造成血细胞溶解,最终致使宿主石斑鱼身体溃烂而死亡[19]。因此研究人员可以通过研究控制丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等酶活的相关方法来达到抑制哈维氏弧菌胞外蛋白酶活性,从而抑制弧菌疾病的目的。

1.2 溶血素

溶血素作为主要的致病因子,在致病性弧菌中分布较广泛[20]。其通过自身的磷脂酶活性作用于宿主红细胞膜的磷脂双分子层,使宿主红细胞膜破裂溶解,血红蛋白以及其它内物质大量溢出,造成细胞溶血。弧菌的溶血素基因多属于TLH和HLX 溶血素基因家族[21],所以具有两个TLH基因的哈维氏弧菌致病能力较强。

1.3 铁载体

铁是微生物生长必不可少的元素,为了维持正常生长,微生物自身便形成了高效的铁获取系统,最常见的是铁载体[22]。铁载体是微生物分泌到胞外的一种可以结合铁离子并将其提供给微生物细胞的离子载体,Kyoungmi等[23]发现其研究的五株哈维氏弧菌的胞外产物中均检测出含有铁载体。与上述两种致病因子不同,铁载体是在当宿主的红细胞受损时,螯合暴露出来的含铁蛋白(血红蛋白、铁传递蛋白和乳铁传递蛋白等),运回病原菌细胞内供其生长繁殖,并造成宿主细胞的铁匮,从而引起宿主的疾病。因此减少水产品的机械损伤，可以控制其因铁载体引起的哈维氏弧菌疾病。

1.4 其他

除了上述几种因素,菌群的密度感应系统、细菌对宿主体内血清的抗性作用以及环境因素也会引起宿主疾病。

1.4.1 密度感应(QS) 密度感应(QS)是基于小信号分子的细胞间通信系统,QS信号的浓度随着环境中细菌数量的增加而逐渐上涨,在达到阈值浓度时,信号分子激活特异性受体以调节QS依赖性基因表达[24]。已有结果表明哈维氏弧菌的三种密度感应系统都有其相对应的自我诱导分子控制自身的生物发光、铁载体、蛋白酶、III型分泌系统、生物被膜的基因的表达[12,25],控制弧菌的致病性。群体密度作为一种控制弧菌疾病的因素,可以根据控制水产品的亩产以及幼苗的投放量并及时发现与移除患病水产品,尽最大可能减少弧菌菌群密度,从而控制弧菌疾病。

1.4.2 血清抗性 细菌感染宿主后,进入宿主血液,会受到宿主血液中的溶菌素、补体等的清除作用。而细菌对于宿主血清的抵抗能力直接关系到其对宿主的致病能力[26]。某些哈维氏弧菌菌株在宿主血清中表现出高存活率,可能是因为其可以抵抗宿主血清的清除作用,从而引起宿主细胞的免疫能力下降而致病。Li等[27]的研究发现哈维氏弧菌能够抵抗宿主血清的清除作用并在宿主细胞内形成凋亡小体引起宿主细胞的凋亡坏死,从而达到其致病的效果。细菌对于宿主血清的抗性作用加强了其对宿主的致病能力。

1.4.3 环境因素 Zha等[28]研究了海水酸化可能会导致血蛤及其病原体哈维氏弧菌的病原体-宿主相互作用发生改变,并使宿主更容易受到细菌感染,故养殖水体环境的非正常改变或者恶化会引起水产品的患病率的上升。还有研究发现,环境因素如pH、温度、氨氮硝酸氮的浓度对哈维氏弧菌的致病性存在影响,其中温度为主要的影响因子[29-30]。

2 哈维氏弧菌的快速检测技术

由于哈维氏弧菌复杂的生理生化及遗传特性,传统的生理生化检测哈维氏弧菌耗时长且效率不高,为缩短检测时间,节省人力物力,如今正逐渐倾向于发展哈维氏弧菌的快速检测方法。

2.1 分子生物学技术

2.1.1 PCR检测技术 近年来,PCR检测技术因其较强的特异性以及灵敏性被广泛用于水产品中各种弧菌疾病以及病毒的检测,可以根据某一弧菌的特定基因来建立特异性检测该弧菌的鉴定方法。廖梅杰等[31]以哈维氏弧菌特异性溶血素基因vhhP2为基础,设定该溶血素基因为靶基因,创建了可以特异性检测哈维氏弧菌的引物。现如今有研究人员通过建立多重引物,对病原菌进行同步PCR检测已取得不错的效果。耿伟光等[32]利用同时设计多种病原菌引物的方法,对患病水产品体内分离出的多种病原菌进行同步检测。检测结果特异性强,且与其他细菌以及宿主无交叉反应。Ana等[33]同样根据三种编码蛋白质基因(opA,ftsZ和mreB)来设计具有种特异性的引物用于区分哈维氏弧菌、轮虫弧菌、坎贝利弧菌等几种近缘弧菌。有研究者建立了快速实时定量PCR鉴定哈维氏弧菌和pVCR1质粒的DNA并对其定量[34],关于哈维氏弧菌的检测,除了上述编码蛋白质的相关基因以及特异性的溶血素基因,还可以利用其基因组中的其他基因如16Sr DNA以及DNA 拓扑异构酶B亚基(gyr B)一以及其它毒力基因等进行PCR 扩增,后将扩增的产物进行序列对比即可得出测定结果。

2.1.2 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术(LAMP)是较PCR分析更为快速的分析检测技术,Cao[35]以及张静等[36]根据哈维氏弧菌tOxR基因上一段保守序列设计出一套LAMP引物进行特异性扩增,实验结果均是除哈维氏弧菌以外,其他的实验弧菌以及细菌均未能扩增出该基因的片段,该方法可以用于特异性检测哈维氏弧菌。Yu等[37]设计的三重LAMP法通过设计三组不同的特异性引物来鉴定三种主要的鱼类致病性弧菌哈维氏弧菌,鳗弧菌和溶藻弧菌,灵敏度是传统PCR分析的102～103倍,是一种能够快速且灵敏度较高的鱼体内弧菌的检测技术。程碟等[38]也利用溶血素基因为检测靶标,建立了LAMP-LED的方法,可以更加清楚方便的检测哈维氏弧菌。与PCR技术一样,LAMP法较普通检测方法提高了检测效率。但是相比于PCR技术,LAMP法增加了引物的量,具有较好的特异性,并且在恒温扩增减少了扩增阶段繁琐的温度循环,降低了对仪器的要求,缩短了检测时间,降低了检测成本;扩增产物可以直接由肉眼观察检测,无需借助仪器检测。但是该方法还存在扩增体系易污染且防疫体系较为复杂等问题亟待解决。

2.2 免疫诊断技术

免疫学方法相比其他检测技术,具有较强特异性,高灵敏性并且易于观察等特点。酶联免疫(ELISA)技术是免疫诊断技术中应用最为广泛的一种,是检测免疫反应产物生成以及产物的颜色来进行定性及定量。早前,Robertson[39]就曾利用ELISA法检测过水体中以及对虾体内的哈维氏弧菌。Kumar[40]等人根据溶血素基因设计了单克隆抗体,采用单克隆夹心ELISA法来检验海产品中副溶血弧菌。较其他克隆方法,该方法更为灵敏,可以将其利用在哈维氏弧菌的检测上。

3 哈维氏弧菌疾病的防治

弧菌是海洋生物以及养殖水产品中的正常菌群,在一定的范围内,不会引起病害,若是弧菌密度急剧增大引起水产品疾病,严重则会导致死亡。目前多使用抗生素抑制病原哈维氏弧菌病害。但是长期使用会引起菌群的耐药性且对身体造成很大的伤害。所以,有效抑制哈维氏弧菌的方法以及新型的无毒害弧菌抑制剂的研究是十分必要的。温度作为影响哈维氏弧菌的致病性的影响因子,通过控制养殖水体温度来达到抑制哈维氏弧菌活性,从而减少弧菌疾病是一个很好的研究方向。有机酸作为抗生素替代添加剂现正在逐渐受到人们的关注,研究用新型微胶囊化有机酸混合物喂养池塘养殖虎虾,发现对于哈维氏弧菌的感染,喂养过后的虎虾有增强免疫的作用,说明有机酸是一种良好的抗生素替代剂[41]。大蒜的提取物也曾被用于研究抑制哈维氏弧菌的活性[42],新鲜的大蒜提取物对于哈维氏弧菌活性的抑制作用为最优。还可以通过多轮菌株毒性实验对养殖水产品进行抗菌体的筛育,Huang等[43]通过对凡纳滨对虾的三轮抗菌体筛选实验,选育出了哈维氏弧菌显著的抗菌体。有研究通过使用群体感应干扰化合物保护巨型淡水虾罗氏沼虾的幼虫免受哈维氏弧菌感染[44],发现该方法不会对幼虾的生长产生负面的影响,但是该方法还需要进一步发展与完善。以上抑制哈维氏弧菌活性以及疾病的方法均是绿色、安全、卫生的,替代抗生素的作用,避免了水产品中的药物残留威胁到人类身体健康。

4 展望

由于哈维氏弧菌复杂的生理生化特性,研究人员对于其致病特性一直在不断的摸索当中。目前,我们对于哈维氏弧菌的检测多在于定性方面,但对其致病性及其致病能力的强弱检测方法则无相关报道。因此对于哈维氏弧菌的致病性以及致病能力强弱的研究是现在所迫切需要的。代谢组学技术通过对生物体或细胞代谢产生的物质进行定性定量分析可以很好的利用到哈维氏弧菌的检测当中。目前代谢组学技术主要有气相色谱-质谱联用技术、液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)以及核磁共振波谱技术(NMR)等。Liu等[45]利用核磁共振技术比较了鳗弧菌和灿烂弧菌对蛤蜊肝胰腺的诱导代谢反应,发现鳗弧菌在蛤蜊肝胰脏中引起的氧化和免疫应激比辉绿弧菌更严重,他们还利用核磁共振技术验证了哈氏弧菌对贻贝的影响主要体现在贻贝体内葡萄糖合成以及ATP/AMP转化途径中诱导渗透破坏并减少能量需求,可以通过参与能量代谢和磷酸胆碱含量所显示[46]。因此作者猜测研究人员可以通过代谢组学技术检测被弧菌感染的水产品,根据其体内免疫应激反应强弱以及能量变化的情况来检测哈维氏弧菌对于宿主的致病强弱。因此预测采用基于代谢组学技术的检测方法可以通过获取哈维氏弧菌侵染宿主后发生的代谢信息的变化,推测出哈维氏弧菌的致病能力,从而建立高速有效的鉴定哈维氏弧菌的致病能力的方法。