乳品有害微生物检测与控制研究进展

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(1.浙江工商大学,浙江杭州 310018; 2.北京三元食品股份有限公司,北京 100163)

乳品中富含各种营养成分且pH呈中性,适宜有害微生物生长。其中有害微生物种类主要包括李斯特菌、蜡状芽孢杆菌、假单胞菌、梭菌、致病性大肠杆菌、弯曲杆菌、霉菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等[1]。研究表明,乳品中有害微生物可引发食品安全问题并影响消费者健康,如假单胞菌、蜡状芽孢杆菌等所产生的色素以及内毒素会造成食品污染以及食品腐败等[2],李斯特菌可导致孕妇流产以及侵袭感染易感个体并导致高死亡率[3]。

据统计中国乳品产业累计产量稳步增长,2018年液态奶产量超过2500万吨,由乳品加工销售收入近3400亿元。随着乳品行业的快速发展和消费者需求的增加,乳品有害微生物关联的质量安全问题引起了广泛关注,可直接影响到乳品的食用安全和消费者的健康,成为研究的热点。鉴于此,如何快速、准确地检测乳品中的有害微生物以及针对性有效控制显得尤为重要,这对推进乳品行业的可持续发展以及保障消费者的健康有着重要的现实意义,同时这也是大健康背景下乳品产业持续推进的需要。

1 乳品有害微生物检测技术

由于乳品行业发展迅速且其中食品安全问题受到广泛关注,因此,如何检测能够引起乳制品质量安全问题的有害微生物就尤为重要。下文对三种乳品中有害微生物检测方法介绍,以期通过这些检测技术保证乳品质量安全。

1.1 PCR技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术在乳品等食品有害微生物检测中已有广泛应用。胡冰雪等[4]建立了荧光假单胞菌、沙门氏菌和单增李斯特菌等有害微生物检测的多重PCR技术。Xiao等[5]则进一步对多重PCR技术进行了研究与拓展,同时引入了高分辨率熔解分析技术,研究证实该方法能够高效地检测乳品中沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌,可应用于乳品中有害微生物检测,特别是对大批量样品检测具有现实指导意义。除多重PCR技术之外,定量PCR因其具有快速、灵敏、可重复性高、污染小等优点,也常被作为食品中有害微生物检测的技术[6]。Katholm等[7]利用RT-qPCR(Real-time Quantitative PCR)成功测定了乳制品中的假单胞菌、链球菌、肠杆菌和芽孢杆菌,为解决乳品中总细菌数高的问题提供帮助。在此之后,Ohkubo等[8]对实时PCR技术进行了改进开展了微生物孢子的定量检测,通过借助于实时PCR与SYBR Green I结合,并利用细胞核荧光探针EMA(Ethidium monoazide)对乳品样品中微生物Anoxybacillusflavithermus和Geobacillusstearothermophilus的孢子进行了定量测定,并在蛋白质含量较高的乳品中精确定量其孢子,该研究成果也有望于应用在乳品微生物的卫生管理中。

除PCR检测技术外,由于传统基因芯片技术也能进行金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测[9],因此将基因芯片技术与PCR技术结合成为乳品有害微生物检测中一类新的方法。Bae等[10]将这两种技术结合应用于乳品中蜡状芽孢杆菌检测,检测限可低至1.0×101CFU mL-1,它不仅适用于食源性有害微生物的快速和现场检测,还具有即时检测(Point-of-care testing,POCT)应用的巨大潜力。除了将基因芯片技术与PCR技术结合,Park等[11]开发了一种将PCR与电化学检测结合的集成生物传感芯片,并成功地将该芯片应用于有害微生物金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌的定量检测。

但由于PCR技术只可检测核酸序列已知的微生物,难以检测未知微生物,并且其检测结果需通过电泳等形式进行可视化,操作较为复杂,因此其在应用中仍有所局限。但借助以上所提及的PCR技术效率高、灵敏等优点,将其作为乳制品中有害微生物的初步检测能够缩短其检测周期,加快对食品中有害微生物的检测。

1.2 ELISA与磁珠分离技术

酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)技术因其高灵敏度、方便快速、特异性高等优点使其逐渐应用于有害微生物检测中。Hamzehlou等[12]将ELISA与显微镜观察法比较研究,结果发现ELISA对结核分枝杆菌的观察下限高,灵敏度好,特异性强,可用于替代显微镜观察法。ELISA技术在对食品中微量微生物检测如金黄色葡萄球菌等具有高效灵敏的特点[13]。目前,Attalla等[14]运用ELISA技术,通过光密度值分析对牛奶中结核杆菌进行定量测定。在微生物检测方面,ELISA技术具有很大的应用价值,因此ELISA技术在乳品微生物检测中也具有极大潜力,但与此同时因ELISA技术其会受抗原间的交叉反应的干扰,且对试剂要求高等缺点导致其未能完全普及,并且由于ELISA技术的特异性导致其难以对多种组分进行同时检测。

依赖于抗原-抗体反应的磁珠分离技术是一种具有高灵敏度和特异性并且能够用于有害微生物的定性和定量分析,同时也无需后续的生化鉴定过程,极大地提高了研究效率的技术。Zhu等[15]利用具有良好生物学和化学性质的天然多糖-壳聚糖合成免疫磁珠,建立了将磁珠与生色介质结合的检测方法来检测奶粉中的坂崎肠杆菌(EnterobacterSakazakii),因其特异性和灵敏性能够为复杂样品中坂崎肠杆菌快速检测提供了新的思路。杨柳等[16]利用免疫磁珠技术与荧光PCR技术相结合用于检测牛乳中的阪崎肠杆菌,结果表明,其对阪崎肠杆菌吸附率为77.7%,证实了其特异性以及灵敏性。但免疫磁珠技术在乳制品有害微生物检测除阪崎肠杆菌外应用不多,仍处于发展阶段,主要面临的问题有其对生物细胞活性的影响以及所提微生物纯度不高等。

1.3 LAMP技术

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种简单、高效的有害微生物检测技术。LAMP技术相较于PCR和实时PCR等技术而言,具有对使用者的技术要求低和样品的检测成本低等优势。Zhao等[17]利用靶向沙门氏菌siiA基因开发了一种快速、特异、灵敏的LAMP-LFD(Lateral Flow Dipstick)技术用于检测婴儿配方奶粉中的沙门氏菌,siiA调节蛋白对于SPI4(Salmonellapathogenicityisland)编码的I型分泌系统的功能体现是必要的[18],并且该调节蛋白可以影响沙门氏菌毒性基因的表达敏感性。

此外,根据Zhou等[19]的后续研究利用光敏反应DNA结合染料叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)进一步优化了检测方法,消除了携带的潜在污染,使其应用更为广阔,能够更快检测乳品中的大肠杆菌和沙门氏菌。目前利用LAMP技术对牛奶中支原体进行检测,整个过程可在1 h内完成,大大缩短了检测时间[17]。但由于LAMP技术使用系统为开放系统,所以易造成环境污染。

2 乳品有害微生物控制技术

微生物安全仍是当前乳品行业中的一个主要的问题。原料乳采集以及加工过程均存在微生物污染的风险,因此如何控制乳品中有害微生物是乳品生产过程中的关键。巴氏杀菌法是目前较为普及的乳品灭菌技术,同时脉冲电场技术等现代灭菌技术也具有极大的发展应用潜力。

2.1 原料中有害微生物控制技术

在原料奶的生产和验收过程中,由于产奶动物相关疾病的感染可造成有害微生物等污染,其中因乳腺炎引起的二次污染最具有代表性。乳链球菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌、化脓性棒状杆菌等细菌及一些真菌类和病毒均可以引起这类感染,感染后能以亚临床无明显的感染迹象形式存在或者以临床/慢性有明显感染迹象形式存在。针对这类问题,Ruegg等[20]在研究中发现通过采用适当的挤奶设备和规范的操作流程可以显著降低二次污染,借助于原料奶中的体细胞数计数检测(Somatic Cell Count,SCC),以及动物乳头浸渍和抗生素治疗等措施,可以最大限度地减少乳腺炎的发病率及二次感染率。但是,在抗生素的应用方面,不建议不加区别地滥用抗生素,以免通过原料奶直接对消费者构成健康威胁和带来环境的二次污染。

2.2 加工过程中有害微生物控制技术

2.2.1 超高压灭菌技术 超高压处理(Ultra-high-pressure Processing,UHP)简称高压技术(High-pressure Processing,HPP),目前广泛应用在食品中微生物的控制,可以有效控制绝大部分的细菌、酵母菌和霉菌。在研究UHP技术作为标准原料乳加工方法的过程中,Barbosa-Cnovas等[21]检测了不同压力水平(400～600 MPa)和暴露时间(1～5 min)对于接种于原料乳中的致病性大肠杆菌,沙门氏菌和单核增生李斯特菌的作用效果,发现高压处理技术可有效地使致病菌浓度降低5lg(CFU/mL)以上,随后在能最有效控制致病菌的UHP条件下探究了该技术对冷藏期间乳品保质期、颗粒大小和色泽等的影响。与巴氏杀菌乳和生乳相比,UHP(600 MPa,3 min)显著降低了乳品中总活菌数及肠杆菌科和假单胞菌属等,延长了乳品1周左右的保质期。此外经UHP处理的乳品与巴氏杀菌乳相比较好的保留了原始未加工牛奶的粒度和色泽等品质属性。

尽管从技术本身UHP有发展成为乳品行业微生物控制的主流技术的可能,但是Alegbeleye等[22]认为此类技术仍存在一些问题,这些问题限制了其在乳品加工中的全面应用。这些问题即限制性因素除了无法控制微生物孢子之外,还有两个最主要因素。一是需要优化加工模式以确保乳品的全面生产;二是有研究证明UHP等技术可以使天然乳蛋白变性。近期的一项研究评估了UHP方法牛奶蛋白质的影响和免疫原性改变情况[23]。研究结果表明UHP处理会引起乳清蛋白(主要是β乳球蛋白和免疫球蛋白G)的变性从而导致蛋白质聚集和酪蛋白胶束结构扭曲。由此可见,UHP的全面应用仍需要进一步深入研究。

2.2.2 超高压均质化技术 超高压均质化(Ultra-high-pressure homogenization,UHPH)是一种依赖超高动态压力的新兴技术。高压、温度、剪切、空化和冲击的组合优化处理能提供更高质量和更长保质期的商业无菌乳品[24]。与高压均质通常使用的100～200 MPa压力不同,UHPH使用高于200 MPa的压力。Sharabi等[25]的研究表明UHPH能够显著降低乳品总菌数,而对于影响乳品的营养和感官特性并不显著,特别是对乳品的抗氧化能力没有影响,这是巴氏杀菌技术所不具备的技术优势。UHPH基于短时间内温度升高和均质化过程中产生的机械力使微生物失活,期间温度的峰值通常会持续很短的时间,根据Zamora等[26]的报告这个时间不超过1 s。这种温度上升虽然很短暂,但却对微生物的灭活有着显著的效果,并且在一定程度上将热处理对乳品的负面影响最小化,可有效提高乳品稳定性、延长乳品保质期。

虽然UHPH技术在乳品杀菌方面显示出巨大的潜力,且对乳品感官特性没有显著改变,但是Briviba等[27]研究表明,UHPH会在乳品中引起一些物理化学修饰,如包括部分酶的失活、蛋白质结构改变、脂肪球变小以及表面蛋白的修饰等。此外,研究表明150～450 MPa压力条件下处理15 min,会引起重构的胶束酪蛋白浓缩物和乳蛋白浓缩物发生显著变化[28]。

2.2.3 脉冲电场技术 脉冲电场技术(Pulsed Electric Fields,PEF)是一种基于高场强下对食品产生的极短脉冲的连续过程,由于PEF技术可以提高产品质量和稳定性,同时不影响产品和工艺安全,近年来受到广泛关注并作为热巴氏杀菌可能的替代技术得以深入研究。PEF技术能够控制大肠杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌、蜡状芽孢杆菌及乳品中绝大部分有害微生物[29]。研究发现,在15 ℃下使用PEF处理能够使脱脂乳中的大肠杆菌失活,其中脉冲持续时间的增加会改善大肠杆菌的灭活效果,与未处理的原料乳相比,在30 kV/cm和53 ℃出口温度下PEF处理22 μs可以使乳品保质期在4 ℃下延长约3～4 d,效果类似于63 ℃的温和热化处理15 s[30]。同时,PEF可以减少传统热处理对乳品感官和理化性质的不利影响,与常规热处理相比,PEF对乳品中的乳铁蛋白更温和,可以更好地保护其结构和活性[31]。而且相对较低的加工温度和微秒停留时间可促进乳制品质量和营养成分的保留。如在35 kV/cm,70 ℃条件下(天然pH)PEF处理重组脱脂乳19 μs,并不会影响乳酪蛋白或乳清蛋白的物理化学性质。

近期相关研究中发现PEF处理改变了复原脱脂乳的流动行为和粘度[32],而且PEF的作用效果通常取决于电场强度、脉冲强度、脉冲数以及脉冲形状等较多参数,针对不同来源和配方的乳品,PEF技术处理条件如最佳脉冲、温度和处理时间等也均需要进一步探究。

2.2.4 微滤技术 微滤是一种低压驱动的膜过滤工艺,该技术主要依赖于膜作用,借助于优化设计使需要的组分通过,同时抑制大多数不需要的组分,从而将包括微生物和孢子的颗粒物质与乳品分离,该技术已成功应用于乳品的冷巴氏杀菌、乳品及乳清中脂肪去除等领域。Mukhopadhyay等[33]认为使用微滤技术物理去除细菌和孢子,可避免热巴氏灭菌及高温高压处理带来的最终乳品产品各种质量问题,其中包括乳品中蛋白质聚集变性、氨基酸损失、风味色泽改变等。如果在巴氏灭菌之前的过程中进行微滤,就能够在不改变乳品营养属性的前提下达到显著延长乳品保质期的目的。有研究表明使用孔径为0.5 μm的微滤膜,100 ℃热处理2 s,能够在室温下生产可稳定保存6～9个月的乳品[34]。另外,微滤技术的使用显著降低了常规添加剂添加的需要,从而可实现不含额外添加剂的干酪和乳清的生产。

2.2.5 栅栏技术 栅栏技术(Hurdle technology,HT)是将具有杀菌潜力的方法和技术整合并优化以获得更加安全、更加被公众接受的产品,这一技术引起了广泛关注并成为研究的热点。栅栏技术涉及到多种同步处理方法,将非热食品加工与传统或其他新兴技术融合在一起,同时基于各种机制抑制或灭活目标有害微生物。这种技术在有害微生物控制方面显示出令人满意的效果同时对食品质量的影响甚微[35]。Evelyn等[36]的研究模拟高压处理与热处理的组合控制乳品中的嗜冷芽孢杆菌,并将结果与仅进行热处理的乳品进行比较。结果表明高压技术进一步增强了热处理控制乳品中蜡状芽孢杆菌孢子的能力。栅栏技术的成功应用包括将微滤技术与超高温处理的组合以控制生脱脂乳中的微生物等,研究证明了微滤技术显著增加了超高温瞬时灭菌处理的乳的储存稳定性[37]。此外,Chugh等[38]采用微滤技术与脉冲电场的组合对原料乳进行加工,处理后的乳品中未观察到脱脂乳的感官品质有显著变化,将该处理所得的产品与仅用微滤处理的样品进行了比较,在后者中观察到明显的产品色泽变化。可见栅栏技术的有效组合策略能够在保持乳品的感官特性的同时确保乳品的微生物安全性。无论何种组合,经过优化和选择,加工的最终目标都是消除有害微生物的威胁和延长乳品保存时间。目前的研究已经逐步在探索了食品工业中使用栅栏技术的各种组合策略。但是,结合乳品产品的多样性和复杂性,仍需要进一步开展有效的工作以建立在乳品领域不同处理的适当组合策略,确保乳品的整体性质和消费者的食用安全。

3 展望

研究发现,在乳品的生产加工中有许多潜在有害微生物污染,包括动物养殖、加工环境以及相关设备等。尽管人们在相关领域已经取得了显著的进步,但乳品生产过程中的有害微生物控制仍无法得到全面保证。除了原料乳污染外,目前加工过程中微生物的残留等可能性因素也会导致乳品的安全隐患。事实证明原料乳中的有害微生物可以在乳品冷藏储存中及巴氏杀菌温度下存活,进一步验证了对乳品加工操作和乳品生产环境进行严格控制的必要性。目前的乳品工业生产系统仍然存在着安全漏洞,应该加以研究和解决。因此借助于新兴技术的发展和检测手段的提升,加强乳品生产中有害微生物检测监控和控制,强化乳品加工中的有效杀菌技术,具有重要的现实意义。