气相色谱法测定发酵乳中的7种短链脂肪酸

丁岩，王娟，张迪

(Ofmom中国有限公司妈咪爱营养研发中心，北京，101300)

短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)通常是指碳链中碳原子数少于6的有机脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸等[1-3]。SCFAs存在于胃肠道中，对胃黏膜有一定的保护作用[4]。乳品在发酵过程中会产生SCFAs，SCFAs是发酵乳的主要风味营养物质之一[5]。

目前，最常用的测定SCFAs含量的方法有液相色谱法[6-9]、气相色谱法[10-14]和质谱法[15-20]，其中高效液相色谱法虽然前处理操作简单，但要求样品基质简单。对于基质复杂的样品，例如发酵乳，则干扰过多，分离度差，定性及定量都较为困难，且需要消耗大量的有机试剂。对于气相色谱法来说，由于羧基的极性较强，在气相色谱柱中容易产生吸附作用，导致结果的重现性差，这种情况尤其在低浓度时会发生，因此SCFAs在进入气相色谱柱前最好进行衍生化，同时衍生化还可以降低这些挥发性酸的蒸发损失[21]。质谱法具有检测灵敏度高，定性准确的优点，但是对于小分子化合物(尤其是分子质量小于50的化合物，例如甲酸)，其在质谱上没有响应或响应很低。气相色谱-质谱联用技术[15-18]基本采用的是全扫描模式，没有充分利用质谱灵敏度高的优势。采用顶空气相色谱-质谱联用技术[17-19]，存在的问题是，样品的基质和标准系列的基质很难完全一致，准确定量存在困难。液相色谱-质谱联用技术检测SCFAs[20]，应用还不是很广泛。另外质谱检测成本过高。

综合考虑，本方法选择用衍生化方法进行前处理，由于衍生物中含有溴元素，所以选择气相色谱带电子捕获检测器进行监测。本方法优化了复杂的衍生化前处理过程，使操作变得简单、快速，消除了杂质干扰，提高了分离度，检测结果准确、可靠，适用于发酵乳中各种SCFAs的测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵乳，实验室自制；脱脂乳粉原料，雀巢公司；丙酮、正己烷，均为色谱纯，默克集团；质量分数为1%的酚酞乙醇溶液、α-溴苯乙酮及18-冠-6醚，sigma公司；Na2HPO4、KH2PO4、H3PO4和KOH，分析纯，百灵威公司；甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸标准品，百灵威公司。

实验室配制试剂：不同质量浓度(2、20、100 g/L)的KOH水溶液；体积分数为0.5%的H3PO4水溶液；磷酸盐缓冲溶液[22](0.08 mol/L的Na2HPO4-KH2PO4水溶液，pH 6.8)：用0.08 mol/L的KH2PO4水溶液调节0.08 mol/L的Na2HPO4水溶液至溶液pH值为6.8；衍生化试剂[22](0.151 mol/L的α-溴苯乙酮和0.006 mol/L的18-冠-6醚混合的丙酮溶液)：称取α-溴苯乙酮(2-溴苯乙酮)0.300 5 g和18-冠-6醚0.015 9 g于同一10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容到10 mL刻度，充分混匀，根据用量现用现配。

1.2 仪器与设备

7890B气相色谱(带电子捕获检测器(ECD))，Agilent公司；Integral 5超纯水系统，Millipore公司，水的电阻为18.2 MΩ；Centrifuge 5804R离心机，Eppendorf公司；DK-8D水浴锅，常州诺基仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：DB-23石英毛细管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度：270 ℃；检测器温度：280 ℃；分流比：150∶1；进样量：1 μL；载气：氮气；载气流速：1 mL/min；升温程序：初始温度50 ℃，保持10 min，然后以20 ℃/min速率升温至170 ℃，以6 ℃/min速率升温至230 ℃，保持9 min。

1.3.2 预处理

1.3.2.1 样品预处理

取10 mL发酵乳于15 mL离心管中，10 000 r/min离心10 min后，取上清液4 mL(V2)于另一15 mL离心管中，加1～2滴酚酞，用KOH水溶液调上清液至微变淡粉色，此时样品溶液呈弱碱性(强碱弱酸盐电离呈弱碱性)， SCFAs以酸根形式存在。用超纯水定容至5 mL(V1)刻度，混匀后10 000 r/min离心10 min，准备衍生化。如果样品中待测物质浓度过高，可以将样品在衍生化之前稀释f倍后再进行衍生化处理。

1.3.2.2 标准系列预处理

分别称取甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸各0.25 g到同一100 mL容量瓶中，用水定容到刻度，混合均匀。取4 mL配制好的标准溶液于15 mL带5 mL刻度的离心管中，加1～2滴酚酞，用KOH溶液调至淡粉色，然后用水定容到5 mL刻度。此溶液为级别1混合标准溶液，将级别1混合标准溶液逐级稀释，配制7个不同级别混合标准溶液。各级别混合标准溶液的质量浓度如表1所示。

表1 各级别标准溶液中7种SCFAs的质量浓度Table 1 The concentration of 7 SCFAs in each level

1.3.3 衍生化

取0.5 mL样品上清液(或取0.5 mL表1中不同级别的混合标准溶液)于10 mL顶空进样瓶中，加入2 mL磷酸盐缓冲溶液，2 mL衍生化试剂和1 mL丙酮，加盖密封，100 ℃水浴反应40 min，冷却至室温后，取0.7 mL衍生后的样品于2 mL离心管中，加0.7 mL等体积的正己烷涡旋萃取，取正己烷层，进气相色谱分析。衍生化反应式如图1所示。

图1 SCFAs衍生化反应方程式Fig.1 The derivative reaction equation of SCFAs

2 结果与分析

2.1 SCFAs的定性分析

在上述色谱条件下进行检测，得到SCFAs各酸单标标准溶液的色谱图和混合酸标准溶液的色谱图，如图2所示。

图2 七种SCFAs各酸单标标准溶液的色谱图和混合酸标准溶液的色谱图Fig.2 The gas chromatogram of each single acid standard and 7 SCFAs mixed standard

由图2可以看出，发酵乳中可能含有的7种SCFAs得到了很好的分离，保留时间分别为：乙酸25.745 min，甲酸25.884 min，异丁酸26.300 min，丙酸26.498 min，丁酸27.483 min，异戊酸27.729 min，戊酸28.760 min。

2.2 SCFAs的定量分析

一系列的混合标准溶液，按照上述的色谱条件进行测定，以各酸的质量浓度x为横坐标，各浓度对应的峰面积y为纵坐标，制作标准曲线，根据式(1)计算样品中的SCFAs的含量。

试样中各个SCFAs的含量计算公式：

(1)

式中：X：试样中各个SCFAs的含量，mg/L；C：从标准曲线上查得的试样中各个SCFAs的质量浓度，mg/L；V1：样品预处理时的定容体积，mL；V2：样品预处理时的取样体积，mL；f：样品的稀释倍数。

2.3 SCFAs的线性范围、方法定量限和检出限

将各个SCFAs配制成不同级别的混合标准溶液，各个级别的混合标准溶液分别调节pH值和衍生化处理，然后进气相色谱检测，各级别混合标准溶液中各酸质量浓度均为20～7 200 mg/L，根据SCFAs的定量分析方法(2.2)绘制各酸质量浓度和对应峰面积的关系图，即各酸的衍生化效率图，如图3所示。

图3 七种SCFAs的衍生化效率图Fig.3 The derivatization efficiency graph of 7 SCFAs

各酸质量浓度在20～2 000 mg/L之间时，曲线均呈线性关系，随着质量浓度继续增大，从甲酸开始，衍生化效率逐渐下降，所以设定各个SCFAs的标准曲线线性范围为质量浓度20～2 000 mg/L。

各酸质量浓度在20～2 000 mg/L线性范围内的标准曲线方程，如表2所示，标准曲线线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.999。当质量浓度为20 mg/L时，各酸的信噪比均>25，符合信噪比大于10作为定量限的要求，所以设置方法定量限为20 mg/L。

表2 七种SCFAs的线性回归方程和定量限Table 2 The linear regression equations and quantitative limits of 7 SCFAs

注：x为质量浓度，mg/L；y为峰面积。

各酸质量浓度在5 mg/L时，如图4所示，各个SCFAs均有检出，信噪比在8.4～15.4，符合信噪比大于3作为检出限的要求，所以设置方法检出限为5 mg/L。

图4 七种SCFAs的检出限色谱图Fig.4 The detection limit gas chromatogram of 7 SCFAs

2.4 SCFAs的加标回收率和精密度

取脱脂乳粉，配制成质量浓度为100 g/L的脱脂乳，做3个加标浓度，每个加标浓度做6个平行，测定回收率和精密度，结果见表3，结果表明该方法回收率高，重现性好。最低加标浓度设置在定量限上，即质量浓度为20 mg/L；由于甲酸和乙酸本底含量较高，所以甲酸和乙酸的最低加标浓度提高到质量浓度为50 mg/L。加标回收率和结果的相对标准偏差(RSD)均满足实际样品检测的定量要求。

表3 七种SCFAs的加标回收率和精密度Table 3 The recovery and precision of 7 SCFAs mixed standard

续表3

物质名称加标量/(mg·L-1)本底值/(mg·L-1)结果均值/(mg·L-1)回收率/%RSD/%异丁酸20.2819.9998.583.78101.400.00104.30102.863.71304.20321.43105.672.76戊酸21.4622.63105.442.40107.300.00111.49103.903.74321.90341.82106.192.88异戊酸21.7421.5899.283.32108.700.00111.57102.643.71326.10345.46105.942.78

3 讨论

本方法中对标准系列进行预处理时，有两种操作可以选择，第一种先调pH值再逐级稀释，就是本方法使用的操作；第二种就是先逐级稀释再分别调pH值，分别称取甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸各0.25 g到同一100 mL容量瓶中，用水定容到刻度，混合均匀。之后将此混合标准溶液进行逐级稀释，分别吸取每个级别的混合标准溶液各4 mL，分别滴加1～2滴酚酞，用KOH调节至淡粉色，之后分别定容至5 mL刻度。经过结果比对区别很小，所以选择先调pH值再逐级稀释的方式，简化操作。

本方法预处理过程中用KOH调节样品和标准品溶液呈弱碱性，如果不慎KOH过量可以用0.5% 的H3PO4水溶液回调，不影响检测结果。

本方法还可以用于其他水系样品或可溶于水的样品的SCFAs测定的参考，例如果汁，葡萄酒，粪便等。