克氏原螯虾壳高值化利用的研究进展

蔡一芥,马申嫣,程佳琦,范海龙,黄建联,范大明,*

(1.苏州旅游与财经高等职业技术学校,江苏苏州 215104; 2.农业农村部冷冻调理水产品加工重点实验室,福建厦门 361022; 3.江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

克氏原螯虾,属甲壳纲动物蝲蛄科,俗称小龙虾,原产自于美国的东南部,又名路易斯安那州螯虾、美国螯虾,自1918年引入日本后,在1929年由日本输入到我国湖北、苏南等地[1],目前主要分布于长江中下游地区,是最具食用价值的淡水龙虾品种之一。克氏原螯虾的年产量占我国整个淡水龙虾产业产量的70%～80%,并逐年增长。在2017年,我国克氏原螯虾消费量达87.93万吨,占据餐饮服务产业总产值的75%[2]。

虾壳是克氏原螯虾加工后的主要废弃物,干燥虾壳由约40%的碳酸钙,25%～30%的蛋白质,30%～35%的甲壳素以及微量脂类物质等组成[3],但长期以来未能被较好地利用,既浪费资源又污染环境。20世纪90年代初我国小龙虾加工业初起步,目前我国将小龙虾加工成虾仁、虾尾、原味整虾及调味龙虾等几类产品。除了在国内有较好的销售量,还将小龙虾加工产品出口至国外,取得较好的经济效益。克氏原螯虾废弃物生产链逐步健全,形成了甲壳素、壳聚糖、蛋白和动物饲料等系列产品[4]。

因此,以克氏原螯虾虾壳为原料进行开发利用,不仅可以缓解迅猛增长的克氏原螯虾产业对环境污染造成的压力,还可以创造高附加值产品。本文就目前克氏原螯虾虾壳开发利用的研究进展展开综述,总结克氏原螯虾虾壳开发利用过程中存在的问题,并指出我国克氏原螯虾壳工业化生产的开发方向。

1 克氏原螯虾虾壳的开发利用

1.1 甲壳素的提取及应用

1.1.1 甲壳素的提取 甲壳素,化学名为聚-1,4-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖或聚-N-乙酰-D-葡萄糖胺,是一种与纤维素化学结构类似的无定型多糖[5],广泛存在于甲壳纲动物、软体动物、虫类、真菌及一些植物的细胞壁中[6],作为一些植物和海洋生物体内的支撑材料而存在,也是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生资源[7]。克氏原螯虾等产生于食品加工业的废弃物可作为甲壳素工业化生产的原料,并且可根据不同的需求,利用多种方法及辅助手段提取到不同类型的甲壳素及其衍生物[8]。目前常用于提取克氏原螯虾虾壳中甲壳素的方法主要为化学法及生物法,且已有研究者通过辅助以超声波、微波及高压等来优化提取甲壳素的条件。

1.1.1.1 化学法 化学法又称酸碱法,化学法提取甲壳素是目前工业上认可度最高应用最广也最为成熟的制备方法,即在水浴加热的条件下,按照一定的料液比,加入一定浓度的无机酸溶液脱除虾壳中的矿物质,脱除矿物质后的虾壳在流动水下洗至中性后加入一定浓度的碱液,以脱除虾壳中附着在甲壳素纤维表层的蛋白质,反复水洗至中性后再经高锰酸钾或双氧水脱色、洗涤、烘干所得到的白色产物即为甲壳素。通常被用来脱除甲壳中矿物质的酸主要有:稀盐酸、硝酸、亚硫酸、乙酸和甲酸,其中以稀盐酸的使用最为普遍,而通常用来处理克氏原螯虾虾壳用于脱去蛋白质的碱液一般为低浓度的氢氧化钠溶液。Bernhabiles等[9]用1.5 mol/L的盐酸,在室温条件下反应30 min脱除克氏原螯虾壳的灰分,研究表明料液比在1∶10～1∶30 (w/v)范围内对该反应结果影响不显著;用2 mol/L的氢氧化钠在料液比1∶20 (w/v)、45 ℃的条件下反应2 h去除蛋白质;将未脱色甲壳素与丙酮溶液以1∶10 (w/v)的比例混合脱色,再用0.315%的NaClO溶液以1∶10 (w/v)固液比将粗产品静置漂白5 min,得到的甲壳素含灰分和蛋白质分别为0.22%和3.14%。传统酸碱法提取甲壳素由于操作简单被广泛应用于工业生产中,但在该过程中消耗了大量的强酸强碱,且需要经过反复的水洗操作,浪费大量水资源的同时对环境造成了污染,同时生产成本较高。

Kaya等[10]对传统的酸碱提取法进行了改良,在去矿化和去蛋白质之前使用NaClO两次处理样品,该方法可以有效缩短提取时间,提取得到的甲壳素为白色,物理性质与传统方法提取的较为一致。针对目前传统方法中存在的不足,朱凯等[11]尝试先将克氏原螯虾虾壳粉碎,接着用复合脱脂剂去除脂类物质,再进行下一步的酸碱处理,通过这一前处理步骤可以大大减少酸碱溶液的用量,使甲壳素产品的品质得到了显著的提高,同时可减少环境污染和能源消耗。Nguyen等[12]对于已经脱除蛋白质的克氏原螯虾虾壳,使用乳酸替代无机酸并辅以微波强化脱除矿物质的方法制备甲壳素,得到的甲壳素脱矿率达99.2%,且其化学结构与商业甲壳素十分相似,脱除的矿物质中钙含量较高,可作为副产品回收。这一研究成果有利于减少无机酸在提取甲壳素过程中的使用,有效减少虾壳对环境的污染。

1.1.1.2 酶解法 酶解法,即利用蛋白酶的酶解作用水解甲壳中的蛋白质,由于酶解作用局限于去除蛋白质,因此为了达到同时去除虾壳中蛋白质和矿物质以提取甲壳素的目的,通常需要在酸或者红外、超声波及微波的辅助下共同作用。Valdez-Peña等[13]选择碱性蛋白酶、溶菌酶、风味蛋白酶等5种不同的蛋白酶进行虾壳酶解实验,以虾壳的蛋白质脱除率为指标,筛选出蛋白脱除能力最强的碱性蛋白酶;利用微波的非热效应辅助碱性蛋白酶提取甲壳素,其中甲壳素的产量为22%,能够去除61%的蛋白质,仅含有0.2%的灰分。Younes等[14]以碱性蛋白酶为对照,酶解实验的原料为枯草芽孢杆菌A26(BacillussubtilisA26)、莫海威芽孢杆菌A21(B.mojavensisA21)、麦氏弧菌J1(VibriometschnikoviiJ1)以及棒曲霉ESl(AspergillusclavatusES1)这四个菌种产的蛋白酶,经比较选出具有最佳脱除蛋白质效果的莫海威芽孢杆菌所产的蛋白酶;为优化酶解条件,通过响应面分析确定了用1.5 mol/L盐酸处理经酶解的虾壳,最终能得到88%±6%的蛋白质脱除率,灰分含量仅为1.97%,产量为18.5%±2.3%的甲壳素产品。Younes等[15]将虾壳浸泡在0.5 moI/L的盐酸中并重复两次同样的操作,再将处理后的虾壳洗净,分别尝试使用碱性蛋白酶S.scrofa和A21来各自脱除蛋白质,结果表明这两种酶各自分别可以实现95%的蛋白质去除率和100%的灰分去除率,与此同时能保留甲壳素自身99%的乙酰度,这一方法实现了将化学法与酶法结合共同提取甲壳素,为实现通过生物法高效而又环保制备甲壳素提供了一种全新的思路。

1.1.1.3 微生物发酵法 微生物发酵法主要是将真菌或细菌进行一段时间的发酵,用其发酵产物有机酸和蛋白酶分别脱除虾壳中的灰分和蛋白质,这是目前研究生物法制备甲壳素的热点。乳酸菌是目前常用的一种产酸产蛋白酶菌,葡萄糖分解产生的乳酸能够自发降低培养基的pH,抑制腐败微生物的生长,为乳酸菌的生长创造了良好的环境。发酵产物之一的乳酸可与克氏原螯虾虾壳中的矿物质反应,生成了乳酸钙沉淀,经过简单的水洗步骤便可除去;而发酵产生的蛋白酶则可分解克氏原螯虾虾壳中的蛋白质。这两个步骤的结合实现了通过一步乳酸菌发酵提取甲壳素,发酵参数如接种量、葡萄糖或碳源浓度、发酵时间和反应的初始pH等多个因素都会影响乳酸菌发酵的效率。Mao等[16]用响应面分析法优化嗜热链球菌发酵降解虾壳的参数,经优化能达到83%的灰分去除率和93%的蛋白质去除率。Ghorbel-Bellaaj等[17]用一株绿脓假单胞菌(L.plantarum),在50 g/L葡萄糖溶液中发酵虾壳5天,脱矿率达96%,脱蛋白率达89%。Pacheco等[18]用一株植物乳杆菌(P.aeruginosaA2),在10%葡萄糖、5%接种量、初始pH8.0、35 ℃条件下发酵虾壳144 h,脱矿率达94%,脱蛋白率达91.38%。Liu等[19]发现仅用地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis21886)进行发酵,可以脱除83.1%的蛋白质,而用氧化葡萄糖杆菌(GluconobacteroxydansDSM-2003)发酵可除去95%的灰分,故采用地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖杆菌对虾壳进行联合发酵降解,结果发现在混合发酵时,接种地衣芽胞杆菌并在无葡萄糖的条件下发酵,且60 h后接种氧化葡萄糖杆菌并在高浓度的葡萄糖存在的前提下继续发酵36 h,最终可以达到93.5%的灰分去除率和86.9%的蛋白质去除率。综上所述,较之于传统化学法,微生物发酵法的反应条件更加温和,而且提取得到的甲壳素可保持较稳定的分子结构,并且该反应整体上对环境造成的污染较小。目前研究较多的联合发酵法能够在已有的研究基础上实现更加高效的甲壳素的制备。此外,目前也有研究者尝试在发酵法提取甲壳素之外回收纯化有机钙、蛋白等一系列副产品。

1.1.2 甲壳素的应用 在溶液中甲壳素能与铅、汞、铀等重金属离子形成螯合物,故其最早被应用为一种金属离子的螯合剂。后来,又在印染工业被用作助染剂和活性污泥絮凝剂,在农业领域用于土壤改良剂、农药和肥料,在医药行业用于制作手术缝合线、医用纤维、人工皮肤等[20]。随着研究的不断深入,甲壳素应用逐渐渗透到日常生活的多个领域中[21]。Benhabiles等[9]从克氏原螯虾壳中制备甲壳素及其低聚物,测试其抗菌作用,结果表明甲壳素对革兰氏阴性细菌,大肠杆菌ATCC 25922(EscherichiacoliATCC 25922),霍乱弧菌(Vibriocholerae),志贺氏痢疾杆菌(Shigelladysenteriae)和脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)表现出显著抑菌作用。Chow等[22]通过从甲壳素溶液中生产甲壳素凝胶,然后冻干得到多孔甲壳素基质,制备了一系列多孔甲壳素基质。冷冻干燥之前对甲壳素凝胶不同的各种预处理程序,可获得100～500 mm的基质孔径。研究者发现暴露于这些甲壳素基质的小鼠和人纤维细胞培养物正在生长和增殖,表明使用这些多孔甲壳素基质用于细胞移植可以实现组织再生。

1.2 壳聚糖的提取及应用

壳聚糖,是甲壳素经脱乙酰化得到的产物,具有生物可降解性、渗透性、成膜性等多种优良特性[23],故常将提取得到的甲壳素再经一步脱乙酰化制得壳聚糖,以此更好地应用于工业、农业、食品和医药等领域。目前壳聚糖的制备主要采用酸碱法,但酸碱法处理时间长,且长时间的碱处理易引起壳聚糖降解使其粘度降低。EL等[24]首次在以虾壳制备壳聚糖的三个主要步骤:去矿化、脱蛋白和去乙酰化中使用微波辐射替代水浴加热,并与常规加热制备甲壳素和壳聚糖进行了对比研究。采用傅里叶变换红外光谱法对这两种方法得到的甲壳素和壳聚糖的结构和理化性质,特别是对脱乙酰度进行了表征。结果表明,经24 min的微波辐射,制备的壳聚糖的脱乙酰度可达到82.73%,而使用传统的水浴加热方法想要制备具有相同脱乙酰度的壳聚糖则需要6～7 h甚至更长的时间。微波技术使得提取时间大约减少了约1/16。丁恒生等[25]采用碱浓度45%、微波加热15 min、微波功率280 W制备壳聚糖,发现微波辐射法可快速制备高脱乙酰度、高粘度的壳聚糖,且微波加热提取速度比酸碱法快十倍以上。加这些结果表明,对于处理虾壳,微波辐射是一种更节能、更高效和环保的方法。

壳聚糖添加在食品中可控制血脂[26],低聚壳聚糖对鲜肉有保鲜效果[27],酸性壳聚糖对鸡蛋有保鲜效果。壳聚糖具有抗菌性[28],可提高巨噬细胞的活性从而抑制癌细胞转移,被用于制造治疗肿瘤的药物[29]。Zaki等[30]用添加了从克氏原螯虾虾壳中提取的壳聚糖的饲料连续饲喂鲈鱼30、60和90 d,之后以嗜水气单孢菌感染鲈鱼,发现其明显提高了抗病能力,且随饲喂时间延长抗病能力有增强趋势。齐祥明[31]以从克氏原螯虾虾壳中提取的甲壳素为原料进行脱乙酰化,制得壳聚糖,用此壳聚糖絮凝鱼糜漂洗水中经等电沉淀后的蛋白质以实现回收,加入壳聚糖370 mg/L,在20 ℃的条件下,可获得95%的蛋白回收率,此时废水中剩余的蛋白质量浓度可降至0.37 mg/mL及以下。

1.3 蛋白质、生物钙的提取及应用

克氏原螯虾虾壳中的蛋白质氨基酸成分较为均衡,含人体必需的8种氨基酸,是一种优质的动物蛋白[32]。克氏原螯虾的附肢及鳃中所含的粗蛋白远高于大豆、鸡蛋和牛肉,虾头蛋白质氨基酸种类齐全,脂肪中卵磷脂、脑磷脂、不饱和脂肪酸含量丰富,易于吸收[33]。一般人们提取甲壳质时,蛋白质均溶解于碱液中,失去了蛋白质的利用价值。目前常使用回收蛋白的方法主要有等电点法沉淀法和酶水解法,以此获取高使用价值的氨基酸营养素。

夏士朋[34]根据蛋白质具有带电性及其等电点的特征,在经稀碱脱蛋白的处理的虾壳液中中加入盐酸调节pH,在等电点处沉淀蛋白,结果表明当pH<5时蛋白质迅速凝聚沉淀,而此后即使pH再降低,蛋白质的析出量也不再发生变化。陈娜[35]以工厂中加工克氏原螯虾产生的废弃物为原料,利用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶对其进行水解,筛选得木瓜蛋白酶为其中水解能力最强的酶,并采用正交化分析进一步探究木瓜蛋白酶酶解的最佳工艺参数，结果表明固液比为1∶2.5 g/mL,pH7.5,酶用量6000 U/g,在55 ℃下酶解5.0 h,其水解度可达28.12%;将水解液离心过滤、喷雾干燥即可制得浓缩的蛋白粉,经检测其所含水分3.2%、灰分3.1%、脂肪3.3%、蛋白质90.2%,可作为调味品、功能食品的补充成分或饲料中蛋白强化添加物使用。

廖晓峰等[36]用胰蛋白酶水解法提取克氏原螯虾虾壳中的生物蛋白钙,经正交试验得最佳反应条件:酶解温度50 ℃、pH7.0、加酶量为l%、反应2 h,此时可提取26.6%的生物蛋白钙,且该产品钙的含量达5.81%,蛋白质含量可达27.53%,产品可用作高级饲料或补钙制剂,解决了日益发展的克氏原螯虾养殖与加工业的中污染和浪费的问题。张文静等[37]采用胰蛋白酶-柠檬酸法从克氏原螯虾虾壳中提取钙粉,研究缺钙的大鼠对复合钙粉的吸收效果，结果表明采用胰蛋白酶-柠檬酸提取复合钙粉的最佳工艺中为:加酶量2.5×103U/g、酶解pH8.0、酶解时间1.5 h、酶解温度45 ℃、柠檬酸浓度为0.4 mol/L、柠檬酸用量20 mL、处理时间1.5 h,此时蛋白水解度达57.2%,钙溶出率为85.8%;提取的复合钙粉中总氨基酸含量为18.3%,钙含量为19.6%。复合钙具有细腻的质地,多呈淡褐色,无异味；该动物实验表明,大鼠可以较好地吸收虾壳中提取的复合钙粉钙,在灌胃剂量达到66.5 mg/(kg·d)时的复合钙粉能明显提高大鼠血清钙、磷水平,促进大鼠正常生长。

1.4 虾壳粉在饲料中的应用

由于在加工过程中克氏原螯虾虾壳往往被作为废弃物,故处理时未过多考虑其卫生安全状态,即使虾壳中含有丰富的蛋白质、甲壳素、氨基酸、钙等营养成分,但此状态已然不适合于人的直接食用,故研究者们尝试将其经简单处理后添加到各种动物饲料中,不仅有利于动物吸收生长过程中必须的营养成分,而且没有造成浪费和污染。最常见的回收利用方法是将克氏原螯虾虾壳自然晒干或风干制成易与运输和储藏的干粉,添加到水产、畜禽的养殖饲料中强化营养。虾壳粉可在添加到鸡饲料中以替代鱼粉,但为避免影响饲养鸡体内氨基酸及矿物质平衡需控制虾壳粉的添加量,虾壳粉还可以在育肥猪饲料中代替鱼粉或肉粉,但因矿物质及甲壳素占比高、脂肪含量低,故热能不佳,应注意补充热能及钙磷平衡的问题[38]。此外,在水产饲料中虾壳粉也可作为着色剂或诱食剂,但如果品质不佳的虾壳粉被添加则相应地也会存在反作用,其中叶玉珍[39]在鲤鱼饲料中用使用虾壳粉替代了鱼粉,养殖效果甚佳;石天亮等[40]在养殖中华鳖的饲料中用虾壳粉替代鱼粉,发现不仅可以降低配方成本,还可提高中华鳖的免疫力。Fagbenro等[41]以糖或者木薯淀粉加入乳酸菌,在30 ℃条件下发酵克氏原螯虾虾壳,可以产出优质的饲料,此法生产的饲料中含有较多蛋白质,故比较适合应用于水产养殖。

1.5 其他应用

克氏原螯虾虾壳除了被应用于提取甲壳素、蛋白质,制备壳聚糖等领域,也有一些较为创新的应用。Li等[42]将克氏原螯虾壳制成生物炭创造性地用于去除三氯乙酸的吸附剂，该合成方法将经ZnCl2溶液改性的克氏原螯虾壳制备ZnO-CFS600。基于Langmuir模型,通过分批吸附测定ZnO-CFS600对三氯乙酸的去除效率,最大吸附容量为17.8 mg/g,与现有研究相比吸附量显着增加。Cai等[43]首次将源自虾壳废料的生物碱作为固体燃料电池的电解质,该电解质在450～550 ℃的温度范围内表现出良好的性能,当使用该电解液在恒电流操作期间电池的电压保持恒定值超过10 h,所制备的燃料电池的实际潜力也得到验证。宋庆洋等[44]比较了丙酮、无水乙醇和石油醚对克氏原螯虾壳中虾青素的提取效果,实验表明在丙酮料液比为1∶20、温度30 ℃、时间2 h、重复提取两次条件下,虾青素加标回收率可达99.2%。

2 克氏原螯虾壳高值化利用中存在的问题

目前大部分废弃的克氏原螯虾虾壳都被应用于提取甲壳素,但化学法提取甲壳素使用了大量的强酸强碱,对环境有着一定的危害,同时整个提取过程耗时较长,存在明显的缺陷。同时在提取甲壳素的过程中,由于使用了较多的强酸强碱导致溶出的蛋白质发生了变性,无法回收,失去了部分具有一定价值的副产物。尽管已经有研究者提出可以使用生物法来替代化学法提取甲壳素,但生物法由于条件过于温和导致处理量小、耗时长,不适合应用于工业生产中,综上可以看出单纯地使用化学法或生物法提取甲壳素都不能较好地满足工业生产的需要。有研究者提出使用微波、超声波等技术辅助化学法改进提取工艺,但就微波辅助而言,现有的研究没有考察在同样的水浴和微波升温曲线条件下提取的甲壳素的质量,因此所得的结果与传统方法提取甲壳素没有可比性。

此外,克氏原螯虾虾壳的部分利用方向的开发研究还较为滞后,例如说从虾壳中提取多不饱和脂肪酸、提取及利用虾青素、开发虾味香精调料等高附加值产品等,都有待进一步研究,这一点不仅需要经济的支持还需要坚实有力的技术支持。随着科学技术的发展,对克氏原螯虾虾壳的开发利用方式也逐渐增多,但目前多数对于克氏原螯虾虾壳的开发利用仍然仅停留在实验室研发阶段,其工艺参数与真正投入工业生产还有较大的差距。

3 展望

作为克氏原螯虾的消耗大国,充分挖掘克氏原螯虾虾壳的潜在价值,具有实现对克氏原螯虾虾壳的充分利用和有效地缓解虾壳产生的环境污染的双重意义。由于实验室研究是微量且精细化的,与实际的工业化大规模生产之间存在诸多不同,如果要将已有的实验研究成果转化为工业生产,还需要进行大批量放大实验,并在放大实验的过程中制定产品品控标准,检测参数指标的变化,并随之调整相应的工艺条件。

今后,克氏原螯虾虾壳的开发方向主要有:a. 甲壳素的工业化生产研究,分析甲壳素工业化生产工艺优化问题,减少化学法提取过程中酸碱的使用量并且能够缩短提取时间,以投入工业中实现大规模的生产,充分发挥克氏原螯虾虾壳的潜在经济价值。拟根据现有的较为成熟的水浴加热的参数,拟合其升温曲线,设置相应的微波程序,精确考察在同种升温条件下,微波的应用对于甲壳素的提取时间、提取率及产品甲壳素质量的影响。b. 对克氏原螯虾虾壳进行分部位提取甲壳素,主要是提高甲壳素的纯度。c. 克氏原螯虾虾壳粉作为饲料原料,从虾壳中提取多不饱和脂肪酸、虾青素,开发虾味香精调料等高附加值产品等的应用研究,提高克氏原螯虾虾壳的利用率和回收率,同时也可对市场上现有虾类产品进行补充优化。