水产品中特定腐败菌分析技术的研究进展

邢家溧，徐晓蓉，丁源，郑睿行，*，张书芬，李湘江，沈坚，李和生，*

（1.宁波市食品检验检测研究院，浙江宁波315000；2.宁波大学，浙江宁波315211）

近年来，随着人们生活水平的提高，人们的饮食习惯呈现出多元化的趋势，从之前的单一饮食品种逐渐改变为现在的饮食品种多样化，水产品在我国国民的膳食占比中的比例正在不断增加[1]。除此之外，由于我国在近几年来已经成为了世界水产品养殖和贸易出口大国，水产品的养殖产量占全世界的70%，其出口额已连续6年位居世界第一[2]，其产量已经连续24年位居世界第一[3]。水产品不仅拥有丰富的营养优质蛋白，同时还具有比较鲜美的味觉享受，因此其备受消费者们的青睐[4]。由于目前我国居民的人均收入在不断的提高，所以人们对健康的生活理念也越来越看重，更多的消费者已经越来越重视食品的质量安全问题[5]。但是新鲜的水产品中往往因为含有较多的水分、可溶性蛋白质和不饱和脂肪酸而容易氧化，再加上目前水产品保藏保鲜技术还不够完善等问题，使得水产品相比于其他一般的动物肉制品更容易腐败变质[6]，从而会对经济造成较大的损失，引起不必要的浪费[7-8]。除此以外，微生物也是大多数水产品腐败的主要原因，从而缩短水产品的货架期，如果能在水产品的贮藏过程中对其特定腐败菌进行控制即可有效延长货架期[9]。水产品中优势腐败菌种类一般与水产品类别有关，不同类别之间存在较大差异，因此仅依靠传统培养鉴定微生物的方法对于大批量研究水产品优势菌并不合理。所以，对水产品特定腐败菌的分析技术进行研究显得尤为必要。这不仅能为水产品中优势菌的研究提供技术支持，也能提高水产品优势菌研究的效率，具有一定的经济效益。目前，国内外研究水产品优势菌的技术主要有基因组指纹（polymerase chain reaction-repetitive extra-genic palindromic，Rep-PCR）分析技术、聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）分析技术、聚合酶链反应温度梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-temperature gradient gel electrophoresis，PCR-TGGE） 分析技术、聚合酶链反应限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）分析技术和高通量测序，本文就这几种技术的应用现状及各自存在的优缺点进行综述，以期为水产品的优势菌研究提供一定的参考作用。

1 特定腐败菌

1.1 特定腐败菌的概念及特征

20世纪末特定腐败菌（specific spoilage organism，SSO）的概念被首次提出，国外研究人员[10-13]对造成水产品品质下降的微生物进行研究后，发现不同的水产品含有的菌相是有差异的，并且起腐败作用的菌类也并非是水产品含有的所有微生物。研究表明，引起水产品腐败的微生物只是所含有微生物中的某几类在参与腐败的过程，这就是该水产品的特定腐败菌[14]。Dalgaard等[15]认为食品的种类不同，其所受的环境影响因子也不同，这意味着只有适合该环境条件的特定腐败菌才会比其他微生物更容易生长，在水产品的腐败过程中不仅能够逐渐占据优势地位，还具有较强腐败活性，从而加快水产品的腐败。特定的微生物针对特定食品的腐败，即该食品特定的腐败微生物[16]。水产品腐败变质的主要表现为其携带的特定致腐微生物在生长和代谢过程中生成了一些不良物质，从而使得水产品在感官上出现了不被消费者所接受的气味、触感和色泽，这些物质主要包括会产生异味的胺类、硫化物、有机酸等[17]。

1.2 水产品中的特定腐败菌

新鲜水产品中的特定腐败菌，其含有的细菌总数在贮藏前期所占的比例并不大，但是在贮藏过程中会由于SSO适应了所处的环境，细菌数目会随贮藏时间的延长而增加，直至细菌对数增长期的出现，以至于在贮藏的中后期水产品中的菌落总数呈迅速增加状态[18]。不同的水产品中含有不同的SSO，有试验结果表明，造成新鲜水产品腐败的SSO主要是附于其表面的腐败微生物，这类微生物多为水产品捕捞之前所处环境中存在的细菌，其中淡水环境中主要包括黄绿假单胞菌、杆菌、棒状杆菌、黄杆菌、芽孢杆菌和沙雷氏菌等；海水产品含有的腐败菌主要为假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、弧菌、肠杆菌等[19]，但是一般情况下，处于相同环境中的同种水产品含有的特定腐败菌也许只存在一种。

水产品经捕捞上岸后，为了保证其新鲜度通常都会被贮藏在温度较低的环境中，通过早前的研究发现，低温贮藏水产品的腐败菌主要有：磷发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）、腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、假单胞菌属（Pseudomonas spp.）等[20-21]。这几种细菌都属于革兰氏阴性杆菌，其中腐败希瓦氏菌和磷发光杆菌都具备将氧化三甲胺（trimetlylamine oxide，TMAO） 还原成三甲胺（trimetlylamine，TMA）的能力，导致水产品出现鱼腥恶臭味[6]。一些水产品可能只含有其中的一种SSO，不同栖息水域的不同的水产品所含有的特定腐败菌种类可能存在较大差异。

2 水产品特定腐败菌分析技术的研究

微生物群落多样性由物种多样性、遗传多样性和功能多样性组成[22]。其中遗传多样性是研究微生物类别的重要关键点。由于细菌的16S核糖体脱氧核糖核酸（16S ribosome deoxyribonucleic acid，16SrDNA）的保守区具备共通性，因此可用于设计通用引物。此外，其可变区的特异性可用来鉴别菌种种类。换言之，16SrDNA是样品总细菌群落结构分析的分子基础。所以采用16SrDNA作为目的序列对各样品中的微生物进行结构分析、鉴定和比对是较为快速与简便的方法[23]。16S核糖体核糖核酸（16S ribosome ribonucleic acid，16SrRNA）基因存在于所有的细菌中，功能同源并且分子大小适宜操作，序列变化与进化距离相等，在系统进化中既高度保守又有可变性，这些特点使其在细菌鉴定、分类和菌落多样性的研究中被广泛应用[24]。由于16SrRNA和16SrDNA的保守性和特异性，随着聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的发展，两者相互促进成为在微生物多样性的研究中常用来作为物种鉴定的重要手段[9]。

2.1 Rep-PCR指纹分析技术

近年来利用细菌基因组指纹分析方法，即细菌基因组重复序列PCR技术（repetitive extra-genic palindromic，Rep-PCR）扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，通过琼脂糖电泳条带比较分析，揭示基因组间的差别[9]。Rep-PCR可以采用多种引物进行扩增[25-27]，与扩增序列进行比对，聚类分析其指纹数据，用来扩充菌株指纹图谱。如大肠埃希氏菌[9]（E.coli）[28]、嗜粪红球菌（Rhodococcus coprophilus）和脆弱拟杆菌HSP40噬菌体（Bacteroides fragilis HSP40 phages）[29]，双歧杆菌属[30]（Bifidobacterium spp）、产气荚膜梭菌[31-33]（Clostridium perfringens），F+RNA 粪便大肠杆菌噬菌体（faecali+RNA coliphages，F+RNA coliphages）[34]并结合微生物源示踪技术（microbial source tracking，MST）[35-36]，已演变为检测细菌的一种重要分子技术。Lin C W等[37]利用脉冲场凝胶电泳（pulse-field gel electrophoresis，PFGE）和3种简单的Rep-PCR方法[即肠细菌重复基因间共有序列 PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR，ERIC-PCR），以BOX插入因子（细菌基因组重复序列）为基础的PCR技术BOX-PCR和重复基因外回文PCR（Rep-PCR）对评估20株嗜麦芽窄食单胞菌分离株遗传相关性进行了比较。在该研究中发现，与PFGE相比，ERIC-PCR表现出较低的区分能力，但是BOX-PCR与Rep-PCR对近亲遗传相关的分离物具有比较明显的区分程度。这表明BOX-PCR与Rep-PCR是评估嗜麦芽窄食单胞菌分离菌株遗传相关性较为简单便捷的方法，该研究为探索嗜麦芽窄食单胞菌的流行病学提供了更为简便的分析技术。Mohammadjavad Paydar[38]等利用Rep-PCR分析技术对采购于马来西亚不同地点的150份海鲜样本的副溶血性弧菌分离株进行了分析，这些海鲜样品包括鱼、小虾、明虾、蜊、牡蛎、蛤和乌贼。试验结果表明，使用Rep-PCR技术来表征副溶血性弧菌分离株可以观察到41个Rep谱，并且所有分离株在80%的相似性下被分类为11个不同的簇，该研究中副溶血性弧菌的DNA指纹图谱显示了分离株间的高度遗传多样性，并且Rep-PCR能够区分具有不同病毒型的分离株。这表明Rep-PCR技术不仅可以用来区分不同分离株的细菌，还可以用来区分不同病毒型的分离株，并且操作方法相对来说较为简便，可以为水产品特定腐败菌分离菌株的研究提供一定的参考价值。

2.2PCR-DGGE和PCR-TGGE分析技术

基因指纹技术还包括变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和温度梯度凝胶电泳[39]（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE），其原理是利用DNA双螺旋结构的特异性和稳定性结合变性聚丙烯酞胺凝胶电泳方法来分析细菌16SrDNA片断扩增产物，分析微生物区系多样性与优势性[40]。DGGE技术虽然从发明[41]到首次应用之间经历了短短几十年[42]，但其在微生物群落的多样性和种群差异性的检测方面都有着十分显著的优势。单独采用聚丙烯酞胺凝胶电泳只能依据双链DNA分子的正负性分离出差别较明显的条带，但片段长短相同，碱基排列顺序不同的DNA分子却无法被辨别，这就为鉴别微生物群落多样性造成诸多不便。但考虑到DGGE/TGGE技术因为加入了一定量的变性试剂，例如：尿素和去离子甲酞胺或者是设置一系列的温度梯度，以此就能达到把相同大小片段但碱基组成不同的DNA片段区分开的目的。这是由于不同细菌的DNA片段有其特定的DNA解链区域及解链规律[43-44]。DGGE的方法己经成功应用于对养殖杂色鲍肠道微生物菌群的分析中[45]。如比较健康鲍肠道和病鲍肠道微生物组成和差异的研究中比较分析4个成长阶段中杂色鲍肠道微生物组成和差异[46]。张新林等[47]利用PCR-DGGE技术对三文鱼在冷链贮运4℃条件下的腐败机制，通过DGGE指纹图谱显示，三文鱼在贮藏期间微生物多样性逐渐降低，通过分析得知假单胞菌属和希瓦氏菌在贮藏过程中渐渐成为优势腐败菌。该试验结果表明通过PCRDGGE技术可以确定4℃三文鱼的特定优势腐败菌。王慧敏等[48]利用PCR-DGGE分析技术和传统菌落计数方法对处于微冻和冷藏环境中的鲈鱼的优势腐败菌进行了分析对比。从DGGE图谱和菌落计数中都表明，鲈鱼在上述两种环境中产H2S菌和假单胞菌都呈现出最快的增长速率，并且发现鲈鱼的SSO为腐败希瓦氏菌和假单胞菌。由此可见，PCR-DGGE技术在水产品优势腐败菌分析方面已经具备了较为成熟的应用实例，这表明PCR-DGGE的应用能够为建立微生物生长货架期模型提供理论基础。但是目前利用PCRTGGE技术来分析水产品优势菌群的研究还比较欠缺，但是对其他食品的研究还是存在应用实例的，例如顾彩东[49]应用PCR-TGGE技术比较了不同热处理对牛乳杀菌效果；叶姜瑜等[50]利用PCR-TGGE技术对处理聚甲醛废水的污水反应器中的微生物群落结构进行了分析，并且取得较理想的试验结果，这些例子表明利用PCR-TGGE分析技术对水产品中的优势菌群进行分析也具有较大的应用前景，可以为水产品菌群的分析提供进一步的技术支持。

2.3 PCR-RFLP分析技术

限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）技术是在1980年由人类遗传学家Bostein提出[9]。RFLP是进行基因组研究的基础，目前主要被广泛应用于基因定位、生物进化、基因组遗传图谱构建等的研究[9]。限制性内切酶的特异性对微生物基因组DNA片段的有效切割产生了阻碍作用。但是将PCR技术与RFLP分析有机地结合在一起则可以得到简单有效的分子图谱，该技术称为PCRRFLP。用于这一目的的特定基因主要为核糖体RNA基因，其中又以16SrDNA PCR-RFLP的方法最为简便且成熟，因此被广泛应用。其中对根瘤基因、固氮基因、冷藏猪肉的菌相[51]和江口菌相[52]研究都取得了较好的成效。除此之外，Juvonen等[53]利用特异组PCR-RFLP和实时PCR的方法来检测和鉴别啤酒中含有厌氧腐败菌梭状芽胞杆菌。该试验主要通过设计16SrRNA基因324-bp可变区的一对特异性引物，并用凝胶电泳和SYBR Green I染料进行实时PCR来评估终点PCR，试验的目的是为了开发和评估用于检测和区分啤酒中腐败菌的群体特异性PCR方法，该试验结果表明，利用PCR方法测得的试验结果与培养结果相比很大程度上一致，但是PCR方法更为敏感，该开发的PCR方法可以在单个反应中检测到9种所有啤酒腐败菌，并且能够在组群水平之下进行分化，减少了分析时间，如果把这一方法加以改进后应用于水产品的腐败菌种鉴别和分析将会提高水产品中腐败菌分析的效率。潘子强等[54]利用16SrDNA克隆文库结合RFLP技术探讨了导致冷藏真空包装脆肉鲩鱼的SSO。试验结果表明，冷藏腐败的真空包装脆肉鲩鱼中含有12种不同分型的细菌类别，该条件下的SSO主要为分型1和2，占克隆子数的58.92%；通过序列比对以及构建的系统发育树分析显示，大部分克隆子的序列与气单胞菌（Aeromonas sp.）的16SrDNA序列有着最大的相似性，这表明真空包装脆肉鲩鱼冷藏的SSO是气单胞菌（Aeromonas sp.）。这说明利用16SrDNA结合RFLP技术可以简单快速的确定水产品中的SSO。

2.4 高通量测序技术

高通量测序技术主要包括罗氏454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的Solid测序平台[55]。高通量测序技术具有产出量高、耗费少、测序精确且自动化等优点[24]。454测序技术以焦磷酸测序为原理，它不同于其他高通量测序平台的显著特点是读长较长。目前GS FLX测序系统的序列读长已不低于400 bp，对于从头测序等需要长reads的操作，它是较为理想的选择。Solid是借助于连接反应进行的测序平台，其基本原理是通过把四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，进而代替传统的聚合酶连接反应。超高通量是Solid系统最显著的特征。Solexa Genome Analyzer测序平台是采用测序、合成同时进行的原理，实现样本制备的机械化和大规模的平行测序，是一种较低运行成本，较高性价比的高通量测序技术。

高通量测序技术目前己经被广泛的运用于微生物的研究中。如张芹等[56]利用高通量测序技术研究高糖饮食对小鼠肠道菌群的影响。江艳华等[57]通过高通量测序对贮藏于4、15、25℃的虾夷扇贝柱菌群结构及优势腐败菌进行了分析，试验结果表明，4℃的SSO为发光杆菌属（Photobacterium）、别弧菌属（Aliivibrio）和假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas），分别占46.91%、36.82%、11.01%；15℃的SSO为发光杆菌属（Photobacterium，46.97%）和别弧菌属（Aliivibrio，43.33%），25℃的SSO为发光杆菌属（Photobacterium，41.94%）、别弧菌属（Aliivibrio，23.10%）、梭杆菌属（Fusobacterium，10.60%）和乳酸菌属（Lactobacillus，18.61%）。曹荣等[58]基于高通量测序对冷藏0、4、8 d牡蛎的菌群进行了分析，试验结果表明，牡蛎冷藏初期的SSO主要以弧菌属（Vibrio）、希瓦氏菌属（Shewanella）和交替假单胞菌属（Pseudoalteromonas），分别占28.3%，10.3%和7.2%；而在冷藏后期，Vibrio的比例迅速下降，而Shewanella和Pseudoalteromonas在冷藏后期仍然为SSO。这说明利用高通量测序可以对水产品在不同贮藏环境中的优势菌群进行分析，并且准确性高，在后续研究中可以结合微生物动力学规律用以构建进行货架期预测的数学模型。

3 结论

水产食品从捕捞上岸到食用这一过程中会由于很多因素影响其货架期，其中起关键作用的主要是微生物的生长和代谢过程中产生的一些化学物质导致水产品发生腐败变质，但是并非所有的微生物都会对水产食品的腐败作出贡献，只有其中的一小部分细菌即SSO才是引起水产品变质的根本原因。因此，水产品在贮藏过程中为了延长货架期，对其含有的特定腐败菌进行鉴定并控制是非常有必要的，这表明对水产品中特定腐败菌的分析技术进行研究、创新也是一个不可或缺的重要过程。

通过对水产品中特定腐败菌的分析技术进行研究，可以更好地预测并延长水产食品的货架期，对提高水产品品质具有重要的意义。但是对特定腐败菌进行研究分析的方法仍存在一些不足之处，例如DGGE方法在应用过程中由于样品处理方法过于繁琐，对微生物的检测灵敏度和测序通量都较低等因素不足以简便而全面地检测水产品中的微生物多样性，除此之外，单一的技术方法在分析水产品特定腐败菌时存在研究结果不理想、分析不全面的缺点。因此在研究过程中如何选择省时、省力、性价比高的分析方法是一个值得探讨的问题，未来可以考虑将两种或两种以上的分析技术相结合或者开发出更为合理、更有应用前景的水产品SSO的分析技术方法。

4 展望

通过水产品SSO随时间变化的趋势与描述微生物动力学生长的数学方程如：Logistic方程、Gompertz方程等相结合可以制作水产品剩余货架期的预测模型，由预测模型编制出相应的软件，用于提醒消费者该水产品的食用期限，避免浪费，并且提高了通过感官来辨别水产品新鲜度的准确性和有效性。虽然在研究过程中面临着种种挑战，但是非常有应用前景。