植物源细菌群体感应抑制剂的研究进展

唐甜甜1,许 杰2,*,吴 涛

(1.中国农业科学院农产品加工研究所,农业部农产品质量安全收贮运管控重点实验室,北京 100193;2.滨州职业学院生物工程学院,山东滨州 256603;3.滨州学院生物与环境工程学院,山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心,山东省黄河三角洲生态环境重点实验室,山东滨州 256600)

细菌的耐药性和耐药细菌的感染给临床抗感染治疗带来极大的挑战,已经成为全球医疗领域最关注的问题之一。目前临床上广泛使用的抗生素都是以细菌的蛋白质合成、核酸合成、细胞壁合成和叶酸合成等重要生命代谢过程为靶点,直接杀死微生物或抑制微生物生长,但在这种生存压力的选择下,病原微生物逐渐产生耐药性[1]。因此,有必要寻找新的作用靶点来开发新型抗菌药物,以对抗不断出现的耐药菌株。细菌群体感应(Quorum Sensing,QS)是当细菌数量达到一定浓度才发生的感应现象。研究表明,以细菌群体感应系统为靶标筛选出来的抗菌药物,即细菌群体感应抑制剂(Quorum Sensing Inhibitor,QSI),只抑制细菌群体感应调控的致病行为,而不直接杀死细菌,不会引起细菌耐药性的产生,这为发现新的抗菌药物提供了机会。

近年来,细菌群体感应抑制剂在医学、农业和食品领域研究已经取得一些进展。一些研究表明,QS参与食品腐败过程,调控与食品腐败相关的蛋白质、脂肪、果胶、壳多糖等分解酶活性,并在不同的腐败食品中检测出了不同类型的QS信号分子[2]。依据细菌群体感应原理,可以通过调节植物病原细菌致病基因的表达或利用植物共生细菌的群体感应效应来产生一些对提高宿主抗病性、诱导宿主的系统获得抗性的小分子物质,来对植物病害进行有效的防控,从而提高农业生产效率[3]。因此,干扰群体感应通路让人们在解决细菌耐药性、植物细菌性病害、食品腐败等问题上看到了新的希望。越来越多的研究者通过多种方式从不同来源的生物中筛选群体感应抑制因子,以期找到淬灭细菌群体感应的有效方法。

目前研究最广的细菌群体感应抑制剂来源包括益生菌、藻类、地衣、植物和动物等,其中集中于植物合成的次生代谢产物作为潜在抗生素抑制微生物的研究较多,包括有生物碱、类黄酮、单宁、香豆素、葡萄糖苷、萜类和酚类化合物等。自然界的植物资源十分丰富,据估计,世界上约有80%的人口依赖植物源药物治疗各种疾病[4]。学者[5]通过分析1995～2014年由国际公认科学数据库收录的文献,统计了来自92个植物科的343种植物对72种细菌的体外抗菌活性研究,其中对菊科、豆科、唇形科和大戟科的植物研究最多,研究较多的细菌有金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌。因此,在植物中筛选细菌群体感应抑制剂具有广泛的研究前景。本工作对植物源天然物质作为细菌群体感应抑制剂的研究现状及其作用方式进行阐述,指出了群体感应抑制剂筛选所存在的问题及其研发前景。

1 群体感应系统概述

细菌根据特定信号分子的浓度可以监测周围环境中自身或其它细菌的数量变化,当信号分子达到一定的浓度阈值时,能启动菌体中相关基因的表达,控制或改变细菌的各种生命活动,这就是所谓的群体感应[6]。由于QS可作为菌群的通讯语言调节多种生物学功能,包括微生物被膜形成、毒力因子的表达、抗生素的分泌以及活性物质的生成等病理相关事件[7-8],所以,QS调控系统越来越受到国内外学者的重视。

到目前为止的科学研究证实,在许多单细胞的细菌中,不管是革兰氏阳性菌(G+)还是革兰氏阴性菌(G-),都存在着“群体感应”现象。细菌通过分泌自动诱导(Auto-inducer,AI)分子来调节群体感应,通常情况下,革兰氏阴性菌使用N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactonase,AHLs)作为自诱导物,统称为AI-1(Auto-inducer-1),革兰氏阳性菌通常使用自诱导肽(Auto-inducter peptide,AIPs)来表达,而自诱导物Ⅱ类分子呋喃甲酰硼酸二酯(Auto-inducer-2,简称AI-2)则是唯一同时存在于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中的自诱导因子,被称为通用自感体[9]。这些QS信号分子已经在牛肉、豆芽、蕃茄、海产品和牛奶等多种食品中检测到,并且食物腐败程度会随着信号分子浓度的增加而增加[10]。目前,大量关于群体感应的工作在铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、费氏弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、霍乱弧菌等致命性病原体中展开,多数研究都集中于AHLs和AIP介导的群体感应。

以AHL介导的群体感应为例,干扰病原微生物群体感应的方式有四种,一是抑制信号分子AHL的生物合成,但是由于信号分子AHL的合成主要是酰氨链的合成,所以此途径在抑制信号分子合成的同时也影响到了脂肪酸代谢过程,很难达到只抑制细菌毒力因子产生而不杀死细菌的目的;二是诱导信号分子降解,已在细菌中发现的降解AHLs群体感应的淬灭酶主要有酰基酶和内酯酶,它们通过裂解AHL信号分子的酰胺键或环酯而破坏细胞间的通讯;三是干扰AHL与LuxR型蛋白特异性结合,干扰信号分子与其相应受体蛋白的结合是构建药物筛选模型的理想靶点,当前报道的大多数QS筛选模型也主要基于这一途径;最后是通过抑制DNA转录[11-12]。

2 植物源细菌群体感应抑制剂

研究表明,植物产生的次生代谢产物会抑制细菌产生致病性的毒素和酶类,并抑制细菌生物膜的形成,对QS系统有一定的干扰作用,这些化学物质存在于植物的许多部位,如树皮、树叶、果实和根部等,具有良好的抗菌活性[13]。此外,植物源提取物又因其有效、廉价和安全的特点,已成为抗菌药物最广泛的来源之一。

植物源天然提取物可作为细菌群体感应抑制剂主要是由于植物产生的某些次生代谢产物能降解信号受体(如LuxR/LasR)或是产生与细菌QS信号分子有相似化学结构的物质,此物质可直接与信号分子竞争受体,从而阻止信号分子与受体的结合来调节群体感应[14]。植物源QSI化合物主要来源于观赏、药用植物、海洋或水生植物以及可食用果蔬,包括各种有机(氯仿、甲醇、丙酮等)提取物以及植物精油,抗菌活性成分主要是酚类、醌类、皂苷、类黄酮、单宁、香豆素、萜与生物碱类等。

2.1 海洋或水生植物

由海洋红藻(DeliseaPulchra)产生的卤代呋喃酮是最先发现的并且得到普遍认可的具有抑制QS活性的天然产物,卤代呋喃酮可通过干扰信号分子AHL与受体蛋白LuxR的结合来影响革兰氏阴性菌的群体感应系统[15-16]。Quintana等[17]利用紫色杆菌ATCC31532和大肠杆菌pSB401作为生物传感器,结合圆盘扩散法对加勒比海和巴西海岸的39种海洋生物(26种海绵、7种软珊瑚、5种海藻和1种植虫体)提取物的QSI活性进行评价,结果显示,当用紫色杆菌ATCC 31532作为生物传感器时,39种提取物中有9种(23%)具有QSI活性,其中7种与海绵有关,当用大肠杆菌pSB401作为生物传感器时,7种软珊瑚提取物中有4种具QSI活性,25种海绵提取物中有11种具有QSI活性,此外对海绵进行初步分馏时还发现其中的二氧甾醇和脂质组分可能是良好的群体感应抑制剂来源。

除了从海洋中筛选群体感应抑制剂外,某些水生药用植物也是良好的抑制剂来源。穿心莲氯仿提取物能明显降低铜绿假单胞菌LasI、LasR、rhIL和rhIR等基因的表达[18],且其主要成分穿心莲内酯可显著降低禽类致病性大肠杆菌(APEC O78)的AI-2活性,并且可抑制QS调控基因的转录水平,降低毒力因子表达,从而减少APEC-O78诱导的肺细胞损伤[19]。水生植物菱角叶提取物的主要成分鞣花酸和阿魏酸具有干扰铜绿假单胞菌的第3种自诱导因子假单胞菌喹诺酮信号(PQS)通路的能力,且菱角叶提取物在最小抑菌浓度下对铜绿假单胞菌产生绿脓菌素和弹性蛋白酶的抑制率高达50%和60%,其中丙酮提取物对其生物膜形成的抑制作用为15%,甲醇提取物对生物膜形成的抑制作用可达20%[20]。

2.2 陆生药用植物

2.2.1 精油 用蒸馏的方法从植物不同部位获得的挥发性萜类化合物被称为精油,具有抗病毒、抗菌、抗真菌、抗炎、抗寄生虫和抗氧化性能。研究表明,大多数的精油组分(香芹酮、己醛、香芹醇、柠檬醛、香叶醇、肉桂酸、百里酚、丁香酚、肉桂醛等)在其最小抑菌浓度(MIC)下,对紫色杆菌CV026的群体感应系统均有显著抑制作用,如荧光素的产生及生物膜的形成[21]。薄荷精油中的萜烯类化合物薄荷醇在0.8 mg/mL浓度下,能抑制80%的铜绿假单胞菌产生绿脓菌素,并且可使其生物膜形成率减少69%[22]。牛至精油0.8 mmol/L浓度下对紫色杆菌产生紫色色素的抑制率达高达90%[23],其主要抗QS成分为香芹酚,研究表明香芹酚在3.9 mmol/L浓度时,可使得铜绿假单胞菌中绿脓菌素的产生率减少60%[24]。肉桂精油可干扰以通用信号分子AI-2为基础的细菌QS,增加其对抗生素的敏感性[25],其主要成分肉桂醛可与荧光假单胞菌的LuxR型蛋白相互作用,阻止AHLs与受体分子结合[10]。此外精油对QS系统抑制作用的研究还在桉树[26]、柠檬草[27]、百里香[14]等多种植物精油中展开。

基于精油良好的抑菌效果,精油还可作为协同增效剂,将精油及其成分与抗生素联合使用,会使其应对细菌耐药性的潜力变得更加明显,组合效应超过了其单独使用时各自的作用。苦参叶精油能够通过气体接触将庆大霉素活性提高42.8%,在抗生素治疗中有作为佐剂的潜力[28]。Van等[29]也认为精油和抗生素之间存在浓度依赖性的相互作用。抗生素与具有多种愈合特性的天然抗菌物质(如植物精油)组合具有很高的治疗潜力,但是抗生素-精油组合对抗药细菌的作用机制尚不明确,还需进一步深入研究。此外精油与噬菌体、纳米颗粒和群体感应抑制剂等不同类型抗菌药物的组合也是未来研究的热点。

2.2.2 溶剂提取物 除了用蒸馏方法提取的植物精油外,利用各种有机溶剂(乙醇、氯仿、甲醇等)或水处理植物所获得的提取液也是良好的群体感应抑制剂来源。玫瑰茶多酚提取物使得紫色杆菌CV026中紫色色素的产生量减少87.56%,且对大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的抑制率分别为67.02%和72.90%,并呈浓度依赖性[30]。积雪草乙醇提取物中的乙酸乙酯组分(CEA)在400 mg/mL时可完全抑制紫色杆菌ATCC 12472产生紫色色素,并对其生长无明显影响,同时,CEA还表现出对铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的抑制作用[31]。蒌叶乙酸乙酯提取物以及其抗QS活性成分植醇,对由QS控制的蛋白酶、生物膜形成和疏水性均有较强的抑制作用[32]。黄连木甲醇叶提取物在2和1 mg/mL浓度下对铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的抑制率分别为92%和79%,其主要的抗QS活性成分为类黄酮,这些类黄酮组分对群体感应信号受体LasR蛋白有较高的亲和力[33]。自然界物种资源丰富,越来越多植物的药用抗菌成分被开发出来,相信在不久的将来会有更多的活性成分应用于临床研究。

2.3 果蔬植物

果蔬是饮食中非常重要的一部分,在美国,果蔬的消费约占48%市场,但在种植、运输或储存期间,果蔬极易受到机械损伤和微生物侵染而导致腐败变质,从而造成严重的经济损失。细菌侵入果蔬后,会产生导致果蔬损伤的致病物质,如纤维素酶,木聚糖酶,果胶酶,聚半乳糖醇酶,蛋白酶和淀粉酶等。这些酶类通过作物生长过程中的自然开口或受损部位进入宿主组织,降解果蔬中的果胶,纤维素,半纤维素和其他营养成分,导致细胞坏死和组织损伤。而研究表明,这些酶由细菌的群体感应控制[34]。

面对致病菌的侵染,果蔬中也存在多种防御病原体群体感应和抗氧化活性的次级代谢物,如酚类和黄酮类化合物。草莓、葡萄、苹果和火龙果是很好的酚类化合物的来源,野草莓酚类提取物在其最小抑菌浓度(MCI)下抑制了紫色杆菌群体感应调节的所有表型,包括紫色色素的产生、群集运动和生物膜的形成[35]。不同浆果(蔓越莓、野蓝莓、树莓、黑莓和草莓)和葡萄也显示出了良好的QSI活性,可作为AHL信号抑制剂,并能显著降低大肠杆菌和铜绿假单胞菌PAO1的群集运动能力[14]。此外,柑橘类水果也是QSI良好的来源,包括橙子、柠檬、西柚等,柑橘类水果中含有丰富的类黄酮,黄酮已经被证明能够干扰QS系统相关的生理过程[36],如柚皮苷、香豆素和槲皮素都已被证明是AL-2介导的哈维氏弧菌(V. harveyi)群体感应抑制剂,其中的柚皮苷可显著降低QS控制的相关表型,如紫色色素生产、生物膜形成和蛋白酶的产生[37],西宁、芹菜素则可抑制V. harveyi BB120和大肠杆菌生物膜的形成[38]。从蔬菜中筛选群体感应抑制剂的研究也很多,如菜花,辣根,萝卜,豆芽,胡萝卜,胡椒等,研究表明,香菜精油及其主要化合物芳樟醇具有抗菌、抗生物膜和抗QS活性,其中,香菜精油抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜的形成的MIC值分别为0.8和1.6 mg/mL[39]。

此外,研究表明果蔬中的活性成分结合壳聚糖制成生物可降解薄膜后,其抗群体感应性能会有所增加,黄芩苷和槲皮素类黄酮化合物在用壳聚糖纳米包封后,会增强对大肠杆菌群体感应和生物膜形成的抑制活性[40],壳聚糖基辣椒素薄膜的抗群体感应、抗氧化性和疏水性能力会随着辣椒素浓度的增加而有所改善[41]。

2.4 植物根茎微环境

根际一般是指离根轴表面数毫米范围之内的土壤-根系-微生物相互作用的微区域,其受植物根系分泌物和周围土壤微生物影响较大,拥有着巨大的微生物群,包括各种细菌、真菌、原生生物。植物根系与根际微生物一直处于不断的相互作用中,根际微环境中存在着大量细菌介导的群体感应现象,它们为了适应环境的变化而产生小的化学信号以进行分子间交流,研究表明,与豆科植物相关的大多数根瘤菌都有QS系统,用以调节它们在土壤微生境中的行为,包括与宿主植物建立共生关系[42]。此外,多数植物病原菌都受QS信号分子的调控,能够产生多种AHLs,例如引起植物块根、快茎、果实发生腐烂的软腐欧氏杆菌(ErwiniaAroideae)。

基于植物根系与微生物间相互影响的关系,有不少研究指出从植物根茎部分提取的天然化合物可能具有群体猝灭能力。研究表明,牛蒡根提取物能减弱尿路感染病原体的细菌群体感应[43]。植物蒺藜根水提物对根际相关细菌紫色杆菌有抑制作用[44]。人参水提液可抑制铜绿假单胞菌PAO1中QS控制的LasA蛋白酶、LasB弹性酶等毒力因子的表达,减少AHL分子的合成,其水提液中主要成分为人参皂苷[45]。除此之外,目前关于植物地下根茎研究最多的是大蒜、生姜等辛辣性香料。研究表明,生姜中提取的6-姜醇可通过控制LasR基因表达,调控铜绿假单胞菌介导的菌群感应,影响其生物膜形成[46]。来源于姜科植物的姜黄素可抑制泌尿道病原体(如大肠杆菌)的生物膜形成,用姜黄素处理铜绿假单胞菌PAO1后,其C12-HSL和C4-HSL信号会明显降低(P<0.05),此外姜黄素还可以与传统抗生素协同作用克服病原菌的耐药性,研究表明,姜黄素联合阿奇霉素和庆大霉素对铜绿假单胞菌QS系统具有协同作用,姜黄素的加入大大降低了阿奇霉素和庆大霉素的最小抑菌浓度(MIC)[47-48]。

除了植物根茎提取物之外,从植物根际土壤中分离出的某些细菌可以产生AHL降解酶,如内酯酶和酰基酶,这些细菌被称为QQ细菌,酶降解AHLs是一种很有效的干扰QS的方法。最初从番茄根际土壤中分离出来的铜绿假单胞菌2apa(P. aeruginosa)、荧光假单胞菌(P. fluorescens)、粘质沙雷氏菌(S. marcescens)和亚马逊固氮螺菌(A. amazonense)等生物防治制剂可以用来降低植物病原菌毒力因子的表达,铜绿假单胞菌2apa具有降解AHL的潜力,并能抑制茄科劳尔氏菌(R. solanacearum)生物膜的形成,芽孢杆菌在AiiA基因的作用下可产生内酯酶水解AHL的内酯环。在quiP基因的作用下,铜绿假单胞菌产生的酰基酶可破坏AHLs的酰胺键[49]。

3 问题与展望

目前,越来越多的群体感应信号分子(如AHL、AI-2等)在肉、奶、鱼、果蔬等多种生鲜食品腐败基质中检测到。细菌群体感应作为动植物抗病治疗的理想靶点得到了国内外学者的广泛关注。在这个植物药物广泛应用的新时代背景下,植物代谢产物作为群体感应抑制剂则有望成为解决细菌感染以及耐药性问题的一个有效途径。抗生素与针对抗性细菌的植物代谢产物的联合具有不同的作用机制,有希望会成为治疗微生物抗药性的新选择。

但是群体感应抑制剂也存在许多不确定因素,有研究指出,从自然界得到的天然抑制剂及人工合成抑制剂和有致畸变的效果,因而不能用于工农业和医药业。并且,关于一些抑制剂药物尚不能明确药物确切的作用靶位,也不能排除所筛选的药物对宿主是否有不利的影响,尚需深入研究。此外,在自然界中还存在着一些不能自己介导群体感应抑制,需要转化成另一种物质才成为有效的群体感应抑制剂。所以,关于群体感应抑制剂的研究任重道远,需要人们不断地学习和研究以获得更全面的认识。相信在不久的将来人们可以通过对QS现象的研究,阐明细菌耐药性和致病性的关系,最终找到一种新型的不会对细菌产生耐药压力而又可以消除其致病性的抗菌物质,解决目前与日俱増的细菌耐药性问题。