人源性异种移植模型在胰腺癌个体化治疗研究中的应用

胡斌权, 储海盟, 师长宏

(1. 94895部队卫生队, 漳州 363000； 2. 空军军医大学实验动物中心, 西安 710032)

胰腺癌是一种发病隐匿, 治疗效果及预后极差的恶性肿瘤, 5年生存率仅为9%[1]。手术根治性切除仍是至今唯一可能治愈胰腺癌的方法, 但胰腺癌早期诊断困难, 多数患者确诊时已属晚期[2]。传统的放化疗方案疗效甚微，毒副作用大[3-5], 因此, 选择更为有效安全的药物是迫切需要解决的问题。

基于动物模型上的基础实验可为临床优化用药方案提供理论支持。来自胰腺癌临床手术标本的人源性异种移植(patient-derived xenograft，PDX)模型较好保持了原发瘤的异质性，建立反映患者自身特征的药物评价系统，临床预见性高，应用于胰腺癌药物筛选具有独特优势[6,7]。此外，二代基因测序技术(next-generation sequencing，NGS)的发展极大地推动了肿瘤精准靶向治疗的进程，多项研究表明[8,9]，基于PDXNGS的药物筛选模式(PDX-NGS-based drug screening)在识别新的肿瘤生物标志物、治疗靶点及研究化疗药物的耐药机制上独具优势，在胰腺癌的个体化治疗研究中具有广阔的应用前景。

1 胰腺癌PDX模型建模及基本特征

胰腺癌PDX模型常见的移植方式为皮下移植，如将患者新鲜的肿瘤组织剪为3 mm3碎块，混合适量的基质胶，利用穿刺针移植到裸小鼠背部皮下，命名为P1代；移植瘤生长至1 000 mm3时，异氟烷麻醉小鼠，手术获取肿瘤组织，在另一只裸小鼠皮下进行传代，命名为P2代，以此类推，传代至P5代。此过程中应用组织病理学和基因分型的手段对各代移植瘤进行朔源性分析，确定出合格的实验标本[10,11]。研究[11,12]证实,胰腺癌PDX模型中移植瘤在基因分型检测、组织病理学和生物标志物表达方面均与原发瘤保持了较好的一致性，即使多次传代扩增(5～8代内)，原发肿瘤的生物学信息及遗传特征仍能够被稳定地保留，因而在预测临床治疗反应上优势显著。该研究[11]中，胰腺癌PDX模型的成模率与患者年龄、性别、患病史及肿瘤分化程度等均无显著相关性，发现其与原发肿瘤的大小和淋巴浸润情况显著相关。其中，相比裸小鼠，SCID小鼠移植成模率较高, 可能与其免疫缺陷程度更高有关[13]。常规移植使用的小鼠中，裸小鼠存在T细胞缺乏，SCID小鼠存在T、B细胞缺乏，NOD-SCID小鼠则是一种非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠, 存在T、B、自然杀伤(NK)细胞及补体缺陷，因移植小鼠的免疫筛选作用，使得原发肿瘤的某些异质性可能会在体内传代中丢失，人们在分析PDX模型结果时, 应注意某些表型的缺失，可选择免疫缺陷程度更高的小鼠来降低这种影响[14]。

传统的PDX模型构建中所用标本多数来源于手术切除下的瘤体组织，然而胰腺癌患者确诊时多属晚期，并无手术指证，难以获得术中标本用于移植，这严重影响了该类人群利用PDX模型进行药物筛选的可行性。近期研究报道[15]，对于晚期转移或无法手术切除的胰腺癌患者，可使用活检标本构建PDX模型，标本可在超声内镜引导下通过细针穿刺(fine-needle aspirate, FNA)获得。该研究中移植成功率为33%，由此建立的FNA-PDX模型亦能较好地保留了患者肿瘤和基质组织病理学结构，不仅增加了特定阶段PDX模型的储备及遗传信息的提取，也使得该模型的适用人群更广。胰腺癌进展快，复发率高，在接受化疗或手术的胰腺癌患者中, 中位复发时间为1年，2年内80%的患者复发，可供治疗的时间窗极短，因此，在疾病确诊初期即开始建立FNA-PDX模型、行基因表型及治疗学的研究以评估个体化治疗及疾病复发时的替代方案就显得尤为重要[16]。

2 PDX模型适用于胰腺癌个体化药物筛选及耐药性研究

胰腺癌PDX模型在基因表达和药物反应性方面均与原发瘤保持相对一致，可代替特定患者进行药物筛选，而不同肿瘤患者来源的PDX模型其生物学和遗传学特性会有所不同，对药物的反应性也会有所差别。这样可为不同肿瘤患者筛选出优化的个体化用药方案，同时也可用于耐药机制的研究[17,18]。

研究发现[7]，胰腺癌PDX模型和体外培养的原代肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性是一致的，在两者的耐药组中均存在骨性关节炎相关基因MCF2L基因高表达的情况，表明了MCF2L基因在吉西他滨耐药中起到重要作用。另有研究[17]报道胰腺癌PDX模型用于奥沙利铂、吉西他滨和伊立替康三种药物的疗效及副作用评价。其中吉西他滨抑瘤效果最为显著，伊立替康疗效次之，但副作用最轻。针对实验结果，推荐吉西他滨作为患者的首选化疗药物，而选择伊立替康进行维持治疗。然而, 在将PDX模型的药物筛选结果用于指导临床用药时, 需要重点关注以下几点： ①PDX模型在传代过程中部分原始肿瘤异质性可能会丢失，特定细胞亚群的过度生长，鼠源化间质和免疫微环境无法完全模拟肿瘤在患者体内真实的生长及转移情况； 这些可能造成实验结果的临床预见性降低； ②由于PDX模型代表了不同患者的状况,在筛药过程中化疗药物剂量、治疗频次需要个体化的策略, 通过预实验进行调整； ③同时PDX模型治疗前的分组、治疗时机、治疗周期，停药后观察时间等因素都会影响药物的评价效果[19-21]。

3 基于PDX-NGS的药物筛选有助于胰腺癌的靶向研究

靶向治疗具有准确、高效，毒副反应少等优势，是近年来肿瘤治疗领域研究的热点[22]，主要是依靠肿瘤的基因分析从突变的基因中识别出可干预的靶点，以便确定治疗选择，然而目前胰腺癌的研究中可干预靶点十分有限[23]。PDX模型和NGS技术的成功整合为肿瘤的靶向治疗和个体化治疗研究提供了有效的手段[24]。该研究模式主要是通过NGS技术对癌症患者或PDX模型上的肿瘤组织行高通量基因检测分析，发现临床疗效肯定的靶点及可干预的潜在治疗靶点，预测药物疗效及分析耐药机制，然后利用PDX模型对基因分析后预测的敏感药物进行疗效评价，最终将药物筛选结果用于指导患者临床用药选择，从而提供精准的个体化治疗方案。Guan等[8,9]发现，司美替尼(AZD6244)作为促分裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MEk1)的高度选择性抑制剂在胰腺癌PDX模型上疗效确切，提示MEk1可能成为胰腺癌潜在的治疗靶点。基因测序发现该组胰腺癌PDX模型中肿瘤细胞的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)基因扩增了3.1倍，略高于RECQL4、SOX2、MYC和PIK3CA等其余研究位点，随后通过使用PDX模型对FGFR的抑制剂AZD4547进行疗效评估，发现该抑制剂对PDX模型能起到显著治疗效果，提示其可能是治疗FGFR 1过表达型胰腺癌患者的有效药物，同时，也证实了基于PDX-NGS的药物筛选在识别胰腺癌治疗靶点和个体化药物筛选中具有很高的应用价值。

4 PDX模型在靶向胰腺癌微环境研究中的应用

胰腺癌细胞具有高度异质性，靶向杀伤肿瘤细胞治疗策略针对不同的个体存在较大差异，相比之下，其肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)异质性较小，靶向肿瘤微环境具有高效、广谱等优势[25]。胰腺癌细胞的快速增殖可导致局部营养物质和氧气的相对缺乏，从而产生以缺氧和高代谢压力为特征的TME。缺氧的TME可诱发肿瘤血管生成、免疫抑制及其他大量信号通路的产生，促进癌症的进展和转移[26]。胰腺癌基膜聚糖(lumican)可抑制胰腺肿瘤细胞的生长，在Ⅰ～Ⅲ期的胰腺癌患者中，原发肿瘤基质中存在基膜聚糖的患者经过治疗后的生存时间比原发肿瘤基质中无基膜聚糖的患者长3倍[27]。Li等[26]使用胰腺癌PDX模型探究缺氧对胰腺星形细胞表达和分泌基膜聚糖的影响，发现缺氧降低了基质中星形细胞基膜聚糖的表达，并阐明了部分基质中的基膜聚糖与肿瘤微环境分子间的相互作用及信号通路，为抗肿瘤治疗提供新的理论依据。PDX模型较好地保留了患者肿瘤基质成分，代表了部分人类基质的性质，适合作为靶向基质微环境研究的动物模型，但值得注意的是，随着传代次数增加，鼠源性的基质会逐渐代替人源性基质，目前尚无法明确这些基质成分可保留多久[19]。

胰腺癌微环境中富含不同种类的参与固有免疫和适应性免疫的免疫细胞，在肿瘤细胞的诱导下多数具有杀伤肿瘤的效应性免疫细胞数量减少、功能丧失，这种显著的免疫抑制状态，影响了化疗药物抗肿瘤作用[25]。胰腺癌的免疫治疗其核心是通过解除原有的免疫抑制, 重新增值活化并重启免疫细胞杀伤肿瘤细胞的功能, 其中, T细胞功能的活化是至关重要。临床试验证实[28], T细胞嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor T cells,CAR T)对包括实体肿瘤在内的肿瘤治疗具有良好的临床疗效。Jiang等[29]使用胰腺癌PDX模型对这种新型CAR T细胞进行临床前疗效评价，发现抗间皮素CAR T细胞能有效抑制模型中移植瘤的生长，提示相应临床途径可能成为胰腺癌患者一种新的治疗方式。此外，肿瘤免疫检查点也是潜在的免疫治疗靶点。当细胞毒T细胞上的程序性死亡受体1分子(programmed death 1, PD-1)与肿瘤细胞表面的程序性死亡配体1(programmed death ligand 1, PD-L1)结合时，抑制T细胞激活，使得肿瘤细胞能逃脱免疫系统的杀伤，Cao等[30]研究表明，双靶向配体利达霉素(dual-targeting ligand-based lidamycin)可抑制胰腺癌PDX模型上肿瘤生长的部分原因可能是其抑制了PD-L1/PD-1信号通路，再次验证了肿瘤免疫检查点抑制剂可能为治疗胰腺癌潜在的新途径。近期研究[31]表明，胰腺癌PDX模型中小鼠恶病质的程度与肿瘤负荷无关，而与局部或全身的肿瘤免疫反应密切相关，实验通过筛选出与恶病质发生程度密切相关的细胞因子，为免疫治疗提供潜在的靶点，同时也证明了PDX模型在免疫治疗靶点筛选中的重要价值。近年来，人源化肿瘤模型(humanized patient-derived xenograft, Hu-PDX)已逐渐被用于开展实验，研究证实人的造血干细胞在小鼠体内可以产生各种免疫细胞，相比常规的PDX模型，Hu-PDX模型在小鼠中重建了人体免疫微环境，因而更适用于肿瘤免疫反应方面的研究[32]。加强对肿瘤微环境的研究，通过针对肿瘤细胞以及靶向重塑肿瘤微环境的双重治疗策略，必将在治疗上实现新的突破。

5 展望

胰腺癌恶性程度极高，预后极差，深入了解治疗失败的机制，获取更加高效的治疗方案是亟需解决的问题。人们尝试建立胰腺癌人源性类器官(patient-derived organoids，PDOs)模型进一步提高药物筛选效能，该模型是直接使用患者肿瘤组织来进行体外三维(3D)培养构建的多细胞团，较好地保留原发肿瘤组织的异质性及生物学特性。相比PDX模型，PDOs具有培养周期短、成本低、成功率高等优势，并且由于类器官既可来源于肿瘤组织，又可来源于正常成体组织，故能够用于研发出特异性针对肿瘤细胞而对正常细胞损伤较小的药物。该技术可与PDX模型优势互补，共同推动胰腺癌个体化研究的进程[33,34]。

虽然胰腺癌PDX模型能代表肿瘤细胞的异质性，表现出不同的基因型和表型特征，可替代特定患者进行个体化药物筛选试验[35]。然而，2016年Nature[36]以及N Engl J Med[37]均发文对包括PDX模型在内的精准医学提出质疑，受适用人群、制模周期长、成本高、肿瘤异质性及耐药性等影响，最终真正受益的患者仅占所有患者的1.5%[21]。为此，研究者们应清醒地认识到使用PDX模型指导临床胰腺癌个体化治疗获益人群有限[23]。因此，在强调PDX模型个体化药物筛选的同时，更应关注共性研究的重要性[21,38]，通过整合基因数据、生物标志物及药物反应性等信息，以建立相关的疾病数据库的形式来优化指导胰腺癌患者个体化治疗可能会是更合理的选择[35]。

目前，基于NGS-PDX的研究模式为胰腺癌个体化药物筛选提供了良好的实验平台，为潜在的靶点筛选提供更广阔的视野。随着基因测序技术的普及、大数据与生物信息等交叉学科的不断发展，胰腺癌PDX生物库必将日趋完善。