HPLC-MS/MS法测定人体血液中文拉法辛的浓度

包东伟

摘 要：目的：建立检测血液中文拉法辛的高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）方法。方法：以乙腈为沉淀剂，经蛋白质沉淀，取上清液进高效液相串联质谱系统（LC-MS/MS）分析。结论：该方法操作简单，灵敏度高，特异性强，可用于血液中文拉法辛的定量测定。

关键词：文拉法辛;血液;高效液相色谱串联质谱法

中图分类号：R115 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）23-0250-02

文拉法辛（venlafaxine）是一种全新的口服抗抑郁药，用于治疗抑郁症和广泛性焦虑症，是5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂，具有双抽抑制作用。因其起效较快且不良反应较小，已逐渐成为抗抑郁的一线药物[1]。文拉法辛在体内主要通过肝脏细胞色素P450酶代谢，生成主要活性代谢产物O-去甲基文拉法辛。目前，国内外文献报道的有关文拉法辛血药浓度的测定方法较多，包括荧光检测法[2]、高效液相色谱法[3]、质谱检测法[4-6]等。本文建立高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS），采用蛋白沉淀方法测定血液中文拉法辛浓度。

1 材料与试药

1.1 仪器

台式三重四极杆串接质谱系统（含ESI电喷雾离子源）;U3000二元超高效LC;德国赛多利斯Quintix35-1CN。

1.2 试剂

盐酸文拉法辛，批号：100543-201602，纯度：99.9%，中国食品药品检定研究院。

1.3 色谱条件

分析柱为：Allure PFP Propyl 100mm×2.1mm×5μm，流动相为乙腈：20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液（70：30），流速为200μL/min。柱温为常温。

1.4 质谱条件

电喷雾离子源（H-ESI）正离子选择多反应检测（SRM）扫描分析，定量分析离子对分别为：m/z 278.212→m/z 57.97（文拉法辛）;m/z 290.125→m/z 198.054（地西泮-d5）。

2 标准溶液的制备

在空白血液中分别加入文拉法辛的工作液，配置成文拉法辛浓度分别为1、10、50、100、250、500ng/mL的血液标准液。

3 血液样品处理

精密量取100μL血液，加入内标50μL和沉淀剂乙腈900μL，混旋2min，10000转/min离心2.5分钟，取上清液1μL供LC-MS/MS分析。

4 方法考察

4.1 專属性

分别取6份不同来源的不服用文拉法辛的正常人空白血液100μL，不加内标，按“血液样品处理”项处理，进样分析，得空白样品色谱图。另取空白血3份，1份加内标，1份加分析物，1份加内标和分析物，同法处理，得相应色谱图。

4.2 标准曲线与定量下线

含药标准曲线血液按“血液样品处理”处理后进样分析。以文拉法辛添加浓度为X轴，样品与内标物的峰面积比为Y轴，进行线性回归，经“Equal”权重得文拉法辛标准曲线图。

4.3 精密度、准确度和提取回收率

取24份空白血液，分别配制定量下线及低、中、高质量浓度质控样品各6份，按“血液样品处理”项处理，进样分析，连续测定3批，计算精密度和准确度。

分别配制低、中、高质量浓度的质控样品各8份，其中6份于提取前加入工作液和内标，另2份于提取后加入工作液和内标，进样分析，计算提取回收率。

4.4 稳定性

制备低、高质量浓度的血液质控样品，分别考察在常温光照放置24h、反复冻融3次、-70℃冻存1个月、进样器内24h条件下的稳定性。

4.5 基质效应

分别取6种不同来源的空白血清90μL，按“血液样品处理”处理，得空白基质后，分别加入低、高质量浓度工作液10μL及内标50μL，制备成基质考察样品，进样分析，得分析物与内标峰面积比值A1。用去离子水代替血液，同法操作，得分析物与内标峰面积比值A2。内标归一化的基质因子=A1/A2×100%。

5 结果

5.1 专属性

文拉法辛的保留时间约为3.22min，地西泮-d5的保留时间约为1.83min，血液中内源性物质对目标分析物及其对应内标的测定无干扰，专属性好，见图1。

左及中：空白血液，右上：空白血液添加内标，右中：空白血液添加分析物，右下：空白血液添加内标及分析物。

5.2 标准曲线与定量下限

文拉法辛的标准曲线方程为Y=0.00173148+0.00604996* X（R^2=0.9991），定量下线为1ng/mL（S/N≥10：1），线性范围为1～500ng/mL。

5.3 精密度、准确度和提取回收率

文拉法辛定量下线的批间精密度（RSD）为18.80%，其余在3.38～7.76%之间，准确度为87.83～102.98%，结果见表1。在低、中、高质量浓度下，文拉法辛的平均提取回收率为101.33～104.61%，结果见表1。

5.4 稳定性

含药血液质控样品在常温光照下放置24h、反复冻融3次、-70℃冻存1个月、进样器内24h各条件下稳定，RSD小于15%。

5.5 基质效应

文拉法辛在低和高2个质量浓度水平下的内标归一化基质因子RSD分别为3.61%、4.54%，小于15%，样品测定不受基质效应影响。

6 讨论

本实验采用LC-MS/MS建立的检测人血液中文拉法辛的方法，所需血液样品量少，专属性好，灵敏度高，准确稳定。以乙腈为沉淀剂，采用蛋白沉淀法处理样品，简单快捷，可快速对样品进行定性定量分析。

参考文献

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