PIK3CA rs4975596基因多态性与口腔癌的相关性研究

张永春，王志强，孙晶晶，宋荣学，王冶

口腔癌是世界范围内普遍存在的恶性肿瘤，流行病学统计结果显示，世界各地的年发病例数约为263 000例，死亡例数约为128 000例[1-3]。鳞状细胞癌(OSCC)是口腔癌最常见的病理类型之一，在中国尤为常见。近年来，肿瘤机制的研究深入，但有效的预防和早期诊断OSCC的措施很少见。由于OSCC复发率高，淋巴结转移多见，5年生存率低于50%[4]。PI3K催化亚基(PIK3CA)位于3q26.3，编码1 068个氨基酸，产生124 kD的蛋白质，即PI3K p110催化亚单位α(PI3K p110α)[5-6]。有研究表明，PIK3CA能够参与肿瘤发生发展的过程，且作为致癌基因[7]。PIK3CA基因突变能够导致PI3K p110α的功能增强。通过PI3K p110α的催化功能，PIP3增加，这是激活PI3K/蛋白激酶B( PI3K/AKT)信号通路的重要媒介。为了探讨PIK3CA基因多态性与口腔癌发生的关系，现对50例口腔癌病人以及50例健康人群的外周血标本进行分析，以期为临床口腔癌的治疗以及预后提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料赤峰学院附属医院于2015年1月至2016年11月期间收治了50例口腔鳞状细胞癌病人(口腔癌组)以及50例健康人群(对照组)的外周血样本，其中口腔癌组中男性30例，女性20例，年龄(51.5±5.3)岁，年龄范围为41～77岁；对照组中男性32例，女性18例，年龄(52.6±6.1)岁，年龄范围为43～74岁。口腔癌组与对照组在年龄和性别方面差异无统计学意义(t=0.323，P=0.754；χ2=0.05，P=0.820)，具有可比性。纳入标准：经病理活检确诊者。排除标准：(1)有其他癌症病史；(2)精神异常者。本研究通过赤峰学院附属医院伦理委员会批准，病人或近亲属和健康志愿者均签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1 DNA提取 在所有样本中用酚/氯仿抽提核酸的方法提取外周血的DNA。

1.2.2 引物合成 PIK3CA基因正向和反向的引物合成序列见表1，引物由上海烈冰生物技术有限公司合成。

表1 PIK3CA基因多态性检测的引物设计

1.2.3 聚合酶链式反应(PCR)扩增 预变性95 ℃ 4 min、变性95 ℃30 s、退火56 ℃30 s，延伸72 ℃ 30 s，72 ℃末延伸5 min；共35个循环；酶切体系及条件：10X FastDigest Gren Bufer 2 μL，FastDigestenzyme 1 μL(rs11615使用Eam1105I，rs13181使用AleI)，ddH2O 17 μL，PCR产物10 μL；水浴37 ℃酶切10 min，然后取出立即置水浴65 ℃灭活5 min；使用2%琼脂糖凝胶，电泳45 min，电压设置为145 V。

1.3统计学方法使用Padgragh 6.0统计软件进行分析。采用χ2检验分析Hardy-Weinberg遗传平衡定律和两组间基因型和等位基因频率分布的差异。检验水准取双侧α=0.05。

2 结果

2.1Hardy-Weinberg遗传平衡检验PIK3CA rs4975596的AA、AG、GG基因型在对照组的数目分别为34例、12例、4例，符合Hardy-Weinberg遗传平衡检验(χ2=0.121，P=0.94)。

2.2PIK3CArs4975596基因型和等位基因频率的分布由表2结果可知，PIK3CA rs4975596基因多态性均存在三种基因型，对各基因的三种基因型分布经χ2检验分析发现口腔癌组PIK3CA rs4975596的基因型分布差异有统计学意义(χ2=7.073，P=0.029)，提示不符合遗传平衡。而对照组χ2=3.125,P=0.210，提示符合遗传平衡。

PIK3CA rs4975596的A、G等位基因在口腔癌组的分布频率分别为65%、35%；在正常对照组的分布频率分别为76%、24%；两组间差异有统计学意义(χ2=5.360，P=0.024)。结果见表3。

表2 PIK3CA rs4975596基因型频率分布/例(%)

表3 PIK3CA rs4975596等位基因频率分布/例(%)

2.3PIK3CArs4975596多态性与口腔癌发生的关系分析PIK3CA rs4975596基因的基因型与口腔癌的关系时发现PIK3CA的G(突变型)等位基因与A(野生型)等位基因比较，差异有统计学意义(χ2=6.349，P=0.005)，而KIK3CA的GG基因型与AA基因型比较，差异有统计学意义(χ2=5.831，P=0.034)。结果见表4。

表4 PIK3CA rs4975596基因多态性与口腔癌的关系

2.4PCR扩增对PIK3CA rs4975596位点的野生型、杂合突变型和纯合突变型三种基因型和样本进行PCR扩增，2%琼脂变性凝胶电泳结果显示，PCR扩增的DNA产物片段大小与预期相同，在91 bp附近，每孔只有一条亮带，条带清晰无杂带，PCR扩增特异性好。见图1。

图1 PCR扩增的电泳结果

3 讨论

口腔鳞状细胞的发生、发展是由多种因素参与，通过诱导基因突变、干扰细胞周期调控等机制作用于免疫系统，是协同作用的一个动态过程[8]。这个过程可能涉及多种致癌基因和抑癌基因位点突变、缺失、甲基化和拷贝数的变化等，这些遗传学改变的累积终将引发口腔鳞状细胞癌的发生[9]。根据之前的研究报道显示，PIK3CA参与了肿瘤的发展过程并可作为致癌基因[7]。突变使得基因重复过度活跃，导致PIK3CA出现扩增和PI3Kp110α的增强功能。通过PI3K p110α的催化功能，PIP3增加，这是激活PI3K/AKT信号通路的重要媒介。PIP3与磷酸肌醇依赖蛋白激酶1(PDK1)的C末端同源性结构域结合，激活PDK1。活化的PDK1磷酸化AKT的第308苏氨酸。在此基础上，磷酸肌醇依赖性蛋白激酶2(PDK2)磷酸化AKT的第473位，因此，PI3K/AKT信号通路被激活[10-11]。以前的研究表明，PI3K/AKT信号通路被基因频繁的突变激活以促进肿瘤生长[12]。PIK3CA的遗传多态性还与多种癌症的发生有关，比如头颈鳞状细胞癌[7]，食管鳞状细胞癌[13]，非小细胞肺癌[14]，乳腺癌[5，15]，子宫内膜癌[16-17]，胃癌[18]和直肠癌[19-20]。

本次研究的结果显示，PIK3CA rs4975596基因型与等位基因频率分布差异有统计学意义，并且PIK3CA rs4975596 GG基因型和G等位基因与口腔癌显著相关，说明了PIK3CA rs4975596基因多态性在口腔癌发生过程中是危险因素。本研究中虽然分析了PIK3CA基因型、等位基因与口腔癌发展的关系，但由于样本量局限，在后续研究中需进一步扩大样本数量。遗传多态性在很多癌症研究中被认为发挥着重要作用。PIK3CA正在成为肿瘤细胞存活的关键因素。研究显示，PIK3CA突变通常出现在肿瘤发生的晚期，就在入侵之前或与入侵一致[18]，说明PIK3CA可能与癌细胞的侵袭密切相关。此外，PIK3CA多态性导致肿瘤组织中PI3K信号通路的增强，也表明PIK3CA可能参与肿瘤形成[13]。因此，建立预测性生物标志物用于早期评估口腔癌是非常有必要的，通过检测基因多态性的预处理识别能够指导临床医生开展合理地治疗，对稳定病人病情非常有帮助。我们的研究提出了PIK3CA基因多态性与口腔癌发生的关联，并指出了PIK3CArs4975596 GG、等位基因G能够作为口腔癌发生的危险因素，可以作为早期预防口腔癌的临床标志物。

综上所述，口腔癌病人肿瘤细胞中的PIK3CA多态性与口腔癌发生显著相关，检测其多态性对早期发现口腔癌有一定价值。