Box-Behnken响应面法优选地芍苣冬颗粒提取工艺△

李玉婷，张刚，姜林，*，郝梦，依孜提·帕力哈提，刘怡，张丽娟，张良，唐梅

1.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学第四临床医学院，新疆 乌鲁木齐 830000

随着生活条件的提高，高血压已经成为一种越来越普遍的症状。相关研究[1]表明，18岁以上的高血压患病率约为10.34%，其中男性所占的比例是8.61%，女性所占比例是11.75%。高血压病是最常见的心血管疾病之一[2]，常有心、脑、肾等脏器的并发症引起的重要器官的病变，在很大程度上影响着患者的身体健康。地芍苣冬汤是根据新疆医科大学附属中医医院多年中医周铭心专家临床治疗高血压的经验，以及高血压的发病机理和治疗原则总结而成的经验方。本方不仅对轻中度高血压病有较好的血压控制疗效，还能明显改善高血压患者头晕、头痛、心悸、烦躁、失眠症状，并对腰膝酸软、口干、耳鸣、健忘、手足心热等症状亦能减轻。

此方传统剂型为汤剂，将其开发成颗粒剂则可以克服汤剂服用剂量大、口感差、储存携带不便等不足，且能使其质量稳定。[2]本方由生地、白芍、天麻、龙骨等9味药组成。白芍为方中臣药，有止痛平肝、柔肝补血、收汗敛阴、平抑肝阳等功能。彭珍香等[3]研究证明，芍药苷呈内皮依赖性舒张血管平滑肌，机制可能与其促进NO的合成释放有关。天麻为方中佐药，有息风止痉、平抑肝阳和祛风通络的功能，对于高血压、偏头痛和失眠等有较好的治疗效果。谢世虎[4]研究证明，天麻素与肾上腺素能产生拮抗作用，且能调节血管的收缩作用，使人体的微小血管扩张，进一步控制血压。临床经验表明，天麻在高血压的治疗中，具有非常好的效果，对于患者的冠状动脉血流量有极明显的调节作用。故选择芍药苷及天麻素为化学指标[5]，优化本方提取工艺。此外，通过离体血管环实验得出的离体血管舒张率，将其作为药效学指标，结合化学成分指标，最终确定本方的提取工艺。本实验以综合评分(天麻素含量、芍药苷含量、离体血管舒张率)为评价指标，采用响应曲面法优化提取工艺，为该制剂的工业化大生产提供方案。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1525型高效液相色谱仪(含2489型PAD检测器、Empower Pro工作站，美国Waters公司)；Centra-20型紫外-可见分光光度计(GBC科学仪器有限公司)；BL-420E生物机能实验系统、离体组织灌流装置(安徽正华生物仪器设备有限公司)；AG-135型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(北京永光明医疗仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)。

1.2 试药

天麻素对照品、芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为807-200104、110736-201337)；乙腈色谱纯；其他试剂均为分析纯。

药材饮片均购自新疆玖元堂中药饮片有限责任公司，经新疆维吾尔自治区中医医院李永和主任中药师鉴定均符合2015年版《中华人民共和国药典》相关项下的要求。

2 方法与结果

2.1 天麻素、芍药苷含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 SymmetryShieldTMRP18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5m)；流动相A为乙腈，流动相B为0.05%磷酸溶液，梯度洗脱(0～11 min，2%A；11～12 min，2%～14%A)；流量：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；天麻素检测波长：220 nm，芍药苷检测波长：230 nm[6]。

2.1.2 对照品溶液的配制 精密称取一定量的天麻素及芍药苷对照品，分别制成质量浓度为0.25、1.82 mg·mL-1的对照品储备液。

2.1.3 供试品溶液的配制 称取适量的处方药材，加水10倍量，浸泡1 h，加热回流提取1 h，提取2次。量取其上清液5 mL浓缩蒸干，干膏加少量的色谱甲醇溶解，定容到5 mL容量瓶中，经0.45m的微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 阴性供试品溶液的配制 按处方量分别称取缺少天麻和白芍的药材，按2.1.3方法制备阴性供试品溶液。结果见图1。

2.1.5 标准曲线的建立 配制质量浓度为0.25 mg·mL-1的天麻素对照品溶液，分别取1、2、3、4、5 mL用甲醇定容到5 mL容量瓶中，稀释成质量浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg·mL-1的天麻素对照品系列溶液，如2.1.1项下色谱条件下完成测定，以天麻素浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标，得天麻素线性回归方程：Y=21 059 052X-13 275.4(r=0.999 2)，线性范围0.05～0.25 mg·mL-1。

配制质量浓度为1.82 mg·mL-1的芍药苷对照品溶液，分别取1、2、3、4、5 mL用色谱甲醇定容于5 mL容量瓶中，稀释成为5个浓度梯度的芍药苷对照品系列溶液，如2.1.1项下色谱条件完成测定，以芍药苷浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得芍药苷线性回归方程：Y=5 906 097.353X(r=0.999 2)，线性范围0.364～1.82 mg·mL-1。

2.1.6 精密度试验 精密量取10 μL的混合对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样6次，计算天麻素、芍药苷峰面积的RSD分别为1.16%、1.56%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验 按处方精密称取6份药材，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，如2.1.1项下色谱条件完成测定，计算天麻素、芍药苷峰面积的RSD分别为2.24%、0.92%，表明该方法重复性良好。

注：A.对照品(220 nm)；B.对照品(230 nm)；C.样品(220 nm)；D.样品(230 nm)；E.阴性样品(220 nm)；F.阴性样品(230 nm)；1.天麻素；2.芍药苷。

2.1.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别在0、6、8、12、24、48 h进样10 μL，计算天麻素、芍药苷峰面积的RSD分别为1.40%、2.09%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.1.9 加样回收试验 取2.1.7项下已知含量的供试品溶液6份，分别加入天麻素、芍药苷对照品0.78、6.37 mg，按2.1.1项下色谱条件完成测定，其平均回收率为99.11%、98.48%，RSD分别为2.20%、1.90%。实验结果表示，本品有良好的回收率。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取次数的考察 将加水倍量固定为10倍，浸泡时间固定为1 h，提取时间固定为2 h，分别考察提取1、2、3次的含量，结果各组分含量在1～3次呈增加趋势，但各组分含量2次与3次相差不大，结合实际生产情况选取2次作为响应面试验设计的提取次数。

2.2.2 提取时间的考察 将提取次数固定为2次，加水量固定为10倍，分别按0.5、1、1.5、2 h进行提取，结果各组分含量在0.5～1 h呈增加趋势，在1～2 h呈递减趋势，故1 h为最佳提取时间。

2.2.3 浸泡时间的考察 将提取次数固定为2次，加水量固定为10倍，提取时间固定为1 h，分别提取浸泡时间为0.5、1、1.5、2 h的供试品测定含量，结果各组分含量在0.5～1.5 h呈增加趋势，在1.5～2 h呈递减趋势，故1.5 h为最佳浸泡时间。

2.2.4 加水倍数的考察 将提取次数固定为2次，提取时间固定为1 h，分别提取加水倍数为6、8、10、12倍的供试品，结果各组分含量在8～10倍呈增加趋势，在10～12倍呈递减趋势，故加10倍量水为最佳加水倍数。

2.3 体外血管环实验

2.3.1 大鼠主动脉环的获取 本次实验用颈椎脱臼法处死大鼠，用鼠板固定后从腹部起直至胸腔剪开，配置0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，调节其pH为7.2，用棉花蘸取此缓冲液轻轻地擦拭组织表面以使视野清晰。找到胸主动脉的两端用止血钳钳夹后剪断，快速取出胸主动脉放入盛有已充入混合气体(95%O2+5%CO2)的4 ℃ kerb’s液培养皿中[用蒸馏水配成10倍的母液(mmol·L-1)：NaCl 118、KCl 4.7、MgSO4·7H2O 1.2、NaHCO320、KH2PO41.1、葡萄糖4.5、CaCl21.25]，葡萄糖需要在临用前加入，且需调节其溶液pH在8.1～8.4，将血管在4 ℃的kerb’s液中不断漂洗以去除血管内残余血液，并剪去残余的脂肪组织和结缔组织。将胸主动脉剪成大约3 mm长的动脉环放置于已经通入混合气体的4 ℃ kerb’s液中，备用[7]。

2.3.2 血管环实验 实验时，血管环下端固定，上端通过张力换能器连于自动平衡记录仪，持续通入95% O2+5% CO2混合气体，调节血管环预负荷为1 g。平衡90 min后开始给药。在氯化钾(kcl，40 mmol·L-1)预致血管收缩的条件下，观察不同提取方法的药物对体外血管张力的影响[8]，结果用离体血管舒张率表示。

(1)

2.4 提取工艺优选

2.4.1 响应面试验设计 在单因素试验基础上，固定提取次数为2次，选择提取时间、浸泡时间、加水倍数作为影响因素，以天麻素含量、芍药苷含量、离体血管舒张率为评价指标(根据本方中各化学指标对本方药效贡献程度的大小综合考虑，决定其权重系数分别为25%、35%、40%)，采用Design-Expert 8.0.4 Trial软件试验设计的方案进行研究，结果见表1。

表1 响应面试验设计及结果

2.4.2 模型的拟合 采用ANOVA对各因素进行多元二次回归，得回归方程：

Y=91.41+0.87A+7.68B+9.40C-4.75AB+8.37AC-6.83BC-19.13A2-12.16B2-18.37C2

从表2的方差分析表可以看出，B、C、A2、B2、C2具有显著性影响，影响程度为C>B>A；失拟项为0.328 0>0.05，表明差异无统计学意义；相关系数r为0.968 7，证明该模型拟合很好，可用该模型对试验结果进行测定。根据回归分析结果，得其三维曲面图，结果如图2。

注：A.浸泡时间和加水倍量对综合评分的影响；B.提取时间和加水倍量对综合评分的影响；C.提取时间和浸泡时间对综合评分的影响。

表2 方差分析

注：“—”为无意义的值。

2.4.3 验证试验 通过对实验数据的综合分析，最佳提取工艺：浸泡时间1.62 h，加10.08倍量水，提取时间1.11 h；结合实际生产确定最佳工艺为浸泡1.5 h，加10倍量水提取2次，每次1 h。按优选的提取工艺再进行3次验证试验，结果天麻素、芍药苷平均质量浓度分别为0.59、6.35 mg·g-1；平均离体血管舒张率为71.03%。综合评分和预测值的偏差较小，表明该二项式模型拟合效果良好，可信度高。结果如表3。

表3 验证试验结果

3 讨论

地芍苣冬汤中生地为其君药，其主要成分为梓醇及毛蕊花糖苷，未将其两种成分作为含量测定指标的原因如下：1)处方中毛蕊花糖苷的理论含量小于制剂的万分之一，含量测定指标应体现对制剂质量的可控性，含量低于万分之二已基本没有质控意义，故未将毛蕊花糖苷作为含测指标。处方中梓醇的理论含量为制剂的万分之三，含量也相对偏低；2)梓醇为环烯醚萜类化合物，经查阅文献知其对热和酸不稳定，在酸性条件下可发生化学反应。故猜测其与方中其他药材发生了化学反应，故未能测出；3)查阅文献得知，生地中含有梓醇及能水解梓醇的β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶易被高温破坏，在低温下活性较强。故影响梓醇稳定性的3个主要因素归结为β-葡萄糖苷酶酶解、酸碱度和温度。所以提取梓醇的过程中，考察了β-葡萄糖苷酶抑制剂加入量、pH值及温度对其含量的影响，但是经反复实验摸索，并未测出梓醇。故采用了臣药白芍中芍药苷及佐药天麻中天麻素作为含量测定指标。

离体血管环实验中，在配置离体血管环实验中所需的kerb’s营养液时，最后加入Cacl2时多次出现浑浊现象，考虑到是加入时未快速搅拌以避免形成络合物，改良操作方法后配置出了澄清的营养液。且血管环需放置在4 ℃ kerb’s营养液中以保证血管的存活时间。

本方为治疗高血压的经验方，以君药和臣药中主要化学成分为指标；通过离体血管环实验确定了本方有扩张血管作用，故将离体血管舒张率作为药效学指标以优化提取工艺。其扩张血管作用也为本方降压机制的研究提供了基础。将化学成分指标与药效学指标相结合，对提取工艺进行评价，进一步优化了本方的提取方法，使优选出的工艺更准确可靠，这是本文的一个创新点，同时也为中药复方提取工艺的优化提供了新思路。