食用菌工厂化栽培中菌种扩繁的质量控制浅析*

廖浩锋，周振辉，陈东梅，谢晓丹，陈多扬，何纯旺，张 智，2**

（1.广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510663；2.广东省微生物研究所，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东 广州 510070）

随着我国食用菌工厂化栽培的发展，对菌种质量有了更高的需求。工厂化栽培相比传统自然栽培，对出菇过程的同步性、生长周期有着更为严格的要求，因此高活力的菌种成为企业保证生产效益的关键。一般情况下，食用菌企业自行繁育各级菌种，培养专职人员掌握菌种繁育和优质菌种的质量控制技术，并且建立菌种生产规程来控制菌种的日常生产。本文将探讨食用菌工厂化栽培中如何做好菌种繁育与管理工作。

1 食用菌菌种繁育模式

食用菌菌种是通过继代培养，逐级扩大繁殖的方式生产，根据我国食用菌的生产方式及其质量控制的需要，我国食用菌菌种实行一级种（母种）、二级种（原种） 和三级种（栽培种）的三级繁育体系[1-2]。在菌种繁育过程中，须根据食用菌品种的培育特点设计其扩繁培养和保藏方法，对菌株种性进行维护和复壮等，尽力保持其优良的生产性能。

优质菌种长期稳定的栽培特性对企业的稳定生产起着关键作用。日常生产中，食用菌工厂需要扩繁大量菌种，其中涉及母种继代培养、菌株种性确认和菌种保藏等。目前我国的食用菌工厂化生产企业所用菌种仍然以固体种为主，不同生产企业的菌种繁育模式（常规固体种）有一定的相似之处，都是实行一个品种多个菌株，分批次使用，避免菌种连续扩繁后出现退化，见图1。该菌种繁育模式体现出菌种的来源，继代培养次数，一定的继代培养数量（供给生产所需菌种、观察母种的均一性），母种的培养和保藏，菌种出菇检验和正常生产的菌种供给等。笔者曾按图1制定灰树花（Grifola frondosa）和杏鲍菇（Pleurotus eryngii）的菌种繁育规程，并收到良好效果。规程中要求只保藏第1代和第2代母种，每周转接1次第3代母种，相应第3代母种在长满培养基前转接第4代母种，第4代母种长满培养基前转接二级种，过程中第3代母种和第4代母种不放入冰箱中保藏，第4代母种的菌龄须保持一致性。组织分离得到菌株须经过继代培养3次进行测试菌株的稳定性和均一性后，择优进行出菇栽培测试。第2代母种采用综合PDA和木屑基质培养并保藏。另外不同品种和生产条件下的菌种扩繁模式有所差异，如组织分离时采用平皿、袋栽模式的枝条菌种、开发四级种等。

图1 食用菌菌种的扩繁模式Fig.1 Propagation model of edible fungus strains

近年来，越来越多食用菌企业应用液体菌种栽培杏鲍菇（Pleurotus eryngii）、金针菇（Flammulina velutipes）等品种，相应制种模式是将平皿母种（第4代母种）转接到锥形瓶进行摇瓶培养得到初级液体菌种，再从锥形瓶转接到发酵罐中扩大培养。另外液体菌种还可以作为原种，通过将液体菌种转接到栽培种的培养基上，培养后成为固体栽培种[3-4]。液体菌种作为原种，能够发挥其菌龄整齐一致、发菌快等优点，相应的栽培种制备时间短而且活性较高，适合菌种企业生产固体菌种，以及某些以固体种作为栽培种的食用菌品种。近年来，日本开发的还原性菌种与我国开发的固体液化菌种有相似之处，都是先生产固体状、易磨成浆的固体菌种，再将固体菌种块进行粉碎和加水稀释后作为栽培种使用[3，5]。该类型菌种结合了固体菌种易于运输保存，液体菌种的发菌快、菌龄整齐一致、接种方便等优点，有利于菌种专业化集中生产和液体菌种推广。

2 菌种扩繁的质量控制

2.1 防范食用菌菌种退化的措施

食用菌菌种在继代培养过程中，由于遗传性的变异而引起原品种的优良性状、典型性和一致性部分或全部丧失的现象常称为菌种退化。菌种退化不同于老化，菌种老化是菌丝体随着菌龄的增加而出现的生理衰退现象，导致菌丝活力减退，出菇迟，产量低。菌种退化是一个逐渐发展的过程，一般发生在菌种继代（转管）培养过程，其中很重要因素是菌丝体的细胞发生变异，比如菌丝单核化产生粉孢子，粉孢子容易萌发成单核菌丝，而且单核菌丝能够与双核菌丝发生单双杂交，继而使菌种异质化发生角变[6-7]。菌种退化容易受到遗传（n＋n的核相不稳定）、细胞、生理、培养环境等多方面因素的影响[8]，因此为了控制菌种退化，需要严格控制菌种继代次数；创造菌种生长的良好条件；对菌种进行复壮（包括组织分离、更换培养基、基内菌丝分离）；采取有效方法保藏菌种；防止病毒感染（菌丝尖端分离）；监督检测菌种的退化；栽培测试观察生产周期、同步性、总产量和农艺性状等。

优良菌种的性状特性需要长期的观察体验才能掌握。在专业理论和菌种繁育经验丰富的专业人员手中，菌种的退化也较慢[9]。食用菌企业要建立菌种标准化生产规程和各级菌种正常生长的图片，并且培养专职技术人员进行繁育菌种，要求其从菌种的菌丝生长至出菇的全过程进行观察和检测，筛选培育优质菌种并做详细记录，菌种要在规定使用日期内使用。

2.2 菌种的种性确认

食用菌菌种活力确认贯穿着菌种的繁育、使用等过程。传统评价菌种从“纯，净、壮，润、香”等方面来形容高质量的菌种，并且建立相应形态学检测、生物学特性检测和农艺性状的评价检测方法[10-11]。优质菌种的菌丝纯白、粗壮，长势旺盛且有光泽，生长整齐均匀，分枝多而密，菌落边缘无角变等，培养基湿润、紧贴瓶壁、无干缩、松散等现象。在菌种生长过程中，要连续观察，一切不正常的现象只有在生长过程中才能表现出来，而当菌丝长满培养基表面时，其不正常现象往往会被菌种的过龄而掩盖[9]。不同食用菌品种的菌落形态特征有所差异，而且菌落形态特征与结实性产量有密切关系。如双孢蘑菇（Agaricus bisporus） 的菌落形态和子实体产质量之间存在一定的相关性，即菌落形态相同的菌株间子实体产质量无显著差异，而菌落形态不同的菌株间子实体产质量有显著差异[12-13]。食用菌菌丝在不同条件下培养，其菌丝生长速度、长势、色泽等菌落形态特征存在一定差别，同时菌丝显微结构也会发生一些细微变化[14]。食用菌菌种受环境条件影响大，变异频率高，容易发生退化，活力下降，需要持续纯化复壮。

对于食用菌企业而言，对菌种质量确认的前提是拥有标准化菌种生产规程，建立培养基（原材料、配方、pH值、含水量等）、培养条件（温度、湿度、通风、光照等）和菌种菌龄等方面的质量标准，结合定性与定量指标制定相应图文并茂的操作文件。一般需要控制杂菌污染，对各级菌种检测细菌、霉菌等；观察母种的菌丝生长速度、分枝、锁状联合和空泡现象等，以及菌落形态的气生菌丝状态、色泽、拟拮抗现象、角变等；控制各级菌种的粉孢子，避免菌种退化[15]；针对菌株生理特性进行比色测定，如显色反应测定脱氢酶[16-17]；栽培出菇确认，确认其菌丝长满培养料天数、搔菌后原基出现时间、子实体采收时间、平均产量、培养出菇过程的同步性、子实体外观性状等。综合各方面指标确认菌株的种性和菌种质量[7]。

目前，国内工厂化生产企业的菌种多数来自国外[18]，以母种或自行分离方式引进。引进种要遵照品种的DUS种性测试（特异性、一致性、稳定性）[19]并确认其生长活力后才能正常使用。因此引进的不同支试管种要作为独立的菌株，要分别扩繁观察个体间的生长均一性，确认其菌丝的生长速度一致、菌丝生长呈同心圆状没有角变、菌落的气生菌丝浓密均一、比较不同母种的继代菌种等。确认母种继代培养的稳定性（继代3次，连续观察）后才投入使用；筛选表现优秀的菌株进行小规模栽培试验，进一步将栽培试验中表现卓越的菌株与当前生产用种进行平行栽培，统计和评价菌株的栽培特性是否切换作为生产用种等。

2.3 食用菌母种培养

母种是菌种生产的基础，标准化生产有利于实现菌种质量的均一性。食用菌工厂企业负责菌种繁育的专职人员定期组织分离一定量的优质子实体进行复壮菌株[20]，要选择菌褶还未暴露的子实体，避免孢子的干扰。每支试管种须作为独立菌株。通过比较不同子实体分离得到的试管种（第一代母种）以及转接试管种（第二代、第三代母种）的菌丝生长情况，观察菌丝生长活力、稳定性和均一性，择其优者进行出菇测试，以及根据其二级、三级菌种生长、出菇采收管理等过程的表现进行综合评价。由于出菇测试的时间较长，须结合短期和长期方法进行保藏，保障菌种活性。保藏后母种要活化培养1 d后进行转接，以及要减少冷藏环节避免影响菌株种性[21]。

母种的规范扩繁操作和培养对于菌种质量形成起着基础作用。母种转接时采取纵横划线分块[22]，相应菌种块大小约（3～5） mm×（3～5） mm，接种在试管斜面培养基的中部，有利于菌丝体长成同心圆状。菌落边缘菌丝的遗传物质不够稳定（有丝分裂中，n＋n的细胞核移动不同步），要避免使用。原接种块周围直径1 cm～1.5 cm的菌丝也较老，要去掉，只切取菌丝粗壮、浓密的部位。严格控制母种的菌龄，在菌丝长满斜面前使用或长满80%面积时进行保藏（菌丝生长期内使用或保藏，避免老化）。母种继代培养份数不能过少，注重连续观察并剔除菌丝体中异质化的个体以进行纯化，如拟拮抗线的星点菌落和角变菌落等。接种时室温须处于适宜生长温度，避免高温伤害造成菌种活力下降。母种培养的最适温度要低于生物学上的最适温度2℃～3℃，相应的菌种生长得更为健壮、浓密，接种后萌发快，抗性强。避免菌丝长期在同一培养基上继代培养，如在综合PDA添加维生素B1、酵母膏、小木粒等，或者将综合PDA替换成木屑培养基进行培养和保藏。

食用菌工厂栽培中往往需要对母种多次继代培养才能满足大规模多批次的用种需求，但需要严格控制菌种继代（转管） 次数（一般不宜超过5次，个别变异快的品种不超过3次），防止菌种退化。目前相关研究表明随着继代培养次数的增加，菌种将会发生退化[23-26]，但是不同继代培养方式，菌种的稳定性有较大差异[27-30]。生产实践中须根据实际情况采用合适的继代培养方式，如菌丝长满培养基前（菌丝生长期内）转接继代、采用木屑基质培养木腐菌、转接基内菌丝（PDA基质）和转接尖端菌丝进行复壮菌丝等。笔者曾接触过日本的金针菇（Flammulina velutipes）菌种繁育模式，该模式下母种连续转管继化培养（12次以上）直到确认菌种稳定后才进行保藏，类似于张金霞对黑木耳（Auricularia auricular）的研究结果[26]，在生产过程中实行1个品种多个支线菌株持续扩繁平行使用，及时淘汰和替换存在退化迹象的支线菌株，定期更新菌种。该模式的转管继代培养次数较多，对菌种的遗传稳定性、人员的技能水平和生产的环境条件要求很高。另外菌种继代培养过多次数，即使菌丝生长速度和菌落形态特征无明显变化，菌株的遗传物质实际上也会发生变化（隐性突变）[28]，将导致菌种的稳定性变弱，产量、质量明显下滑。食用菌企业的菌种技术人员须保持团队成员稳定和不断提高自身技术水平，遵守经过规范验证的菌种繁育模式，通过标准化生产均一稳定的菌种，菌株扩繁过程实行优中选优、强制一定的淘汰率，才能有力保障菌种质量。

2.4 菌种保藏

菌种繁育中，需要对具有优良性状的菌株进行保藏以便于持续生产栽培。菌种保藏的原则是尽量降低菌丝的代谢强度，使其处于休眠状态，限制繁殖，降低其变异速度。一般是采用低温、冷冻、减少氧气供给等来保持菌种的优良性状，常用的保藏方法有继代培养、矿物油、蒸馏水、低温、液氮保藏等[31]。

不同保藏方法在成本、效果和人力投入等方面有较大差异，例如，液氮保藏效果最好，但费用昂贵。食用菌企业一般需要依托具有资质的菌种保藏机构进行长期保藏菌种，而企业内部自行对菌种进行中短期保藏，以及确认菌种保藏后的种性表现，即保藏后的菌种需要继代培养3次进行种源维护，确认菌丝的生长速度（PDA基质和木屑基质），菌落特征（色泽有无、浓密或稀疏）的稳定性和均一性，显微观察菌丝粗细、锁状联合、菌丝分枝生长角度等，相关观察结果必须与菌种保藏前特征一致（拍照记录）。保藏前后要使用标准稳定的培养条件，以排除培养条件对菌株的生长影响所造成的差异。

对食用菌企业而言，一般可采用继代培养、蒸馏水、液体石蜡保藏菌丝体。继代培养保藏将保存菌株每隔2个月～3个月时间转管 1次，采用4℃～6℃保藏。目前可生产应用的食用菌，除草菇、姬松茸，毛木耳菌种外，其他菌种可以用此温度保藏[31]。在继代法中可采用橡皮胶塞、包膜、封蜡等封口方式增强保藏效果[32-34]。对于许多木腐类食用菌、药用菌都可用木屑基质保藏法，有助于保持菌株的生活力[28，35]，氮源营养剂宜5%～6%。蒸馏水方法的保藏期较长（或1年～2年转接1次）[36-37]，并且保藏后菌丝恢复生长比较快。蒸馏水覆盖法通过在平皿上选取5 mm～6 mm菌块放入灭过菌的保存管中，每一保存管放入5块～6块菌块，然后往保存管加入灭菌后的蒸馏水，使蒸馏水浸没菌块，置于4℃下保存。取菌块进行保藏时，须注意平皿或试管不同位置菌丝的生理特性有一定差异，以接种块为中心进行等距切取菌种块，有利于提高保藏后菌种的均一性。液体石蜡保藏法适合长时间保藏菌株（或1年～2年转接1次）[34]，其将灭菌并60℃烘烤蒸发水分后的液体石蜡放冷并注入欲保存菌株的斜面，高出斜面1 cm为宜，竖直存放于15℃～20℃环境中。从液体石蜡转接的菌种沾有石蜡油，继代培养2次才能恢复正常生长。

3 结语

菌种质量是影响食用菌栽培经济效益的关键因素。食用菌工厂化栽培中存在大规模多批次的用种需求，需要对母种进行频繁的继代培养，继代培养过程中菌种容易发生退化。因此食用菌企业内部需要根据菌株的生物学特点，建立规范合理的菌种扩繁模式以及各级菌种的质量标准和操作管理等[38-40]。近年来由于食用菌的生物学研究、技术研发的不断探索，菌种制备的相关技术也有了明显的发展，如液体菌种的广泛应用，菌种质量和保藏效果提升等。随着人们对食用菌分子遗传规律、生理代谢过程及其规律的认知加深，工业化和信息化技术的应用和不断优化，将有利于提高食用菌的菌种制备技术水平，促进食用菌工厂化栽培的稳定持续发展。