黑果枸杞组织培养研究

汪清锐,吕林芳

(山西省桑干河杨树丰产林实验局，山西 大同 037000)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)属为茄科枸杞属多年生多棘刺灌木植物，是我国荒漠地区特有的野生植物，主要分布在我国西北地区。黑果枸杞抗寒、抗旱、耐盐碱、耐高温能力强，是保持水土、防风固沙的优良植物资源。其果实富含蛋白质、多糖、类黄酮、氨基酸、维生素及多种微量元素，药用和保健价值远远高于普通红枸杞；还富含特有的原花青素和花青素，是天然的抗氧化剂，具有延缓衰老的作用。近年来，由于自然环境恶化和人为采伐对黑果枸杞植株的破坏，其野生群居数量和规模大面积减少，产量急剧下降。黑果枸杞播种繁殖常常出现遗传分化，目前黑果枸杞育苗主要以嫩枝扦插为主，但扦插育苗繁殖系数低。而利用植物组织培养技术，不仅可以保留植株原有的优良性状，还可以将优良单株快速繁殖成无性系并大量扩繁。但关于黑果枸杞组织培养工厂化育苗的关键技术尚不完善。本研究以室外成熟黑果枸杞种子为外植体，对其不定芽的诱导、增殖、生根进行研究，以期建立野生黑果枸杞组织培养快繁技术，为大面积栽培、开发利用及保护黑果枸杞提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为甘肃黑果枸杞杂交优良品种种子。先用自来水冲洗20 min，用饱和肥皂水将种子浸泡10 min后冲洗干净。放置于超净工作台上用75%的酒精消毒20 s，用无菌水冲洗干净，再用0.1%氯化汞消毒5 min，期间不断晃动，使外植体各面都接触到消毒液。之后再用无菌水清洗5次，获得无菌外植体材料。

1.2 方法

1.2.1 初级培养

将种子接种到MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，MS+6-BA 1.0 mg/L+GA30.5 mg/L，MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L 3种培养基中萌发无菌苗。培养基蔗糖用量30 g/L，琼脂粉用量5.6 g/L，pH值为5.8(下同).每瓶接种20颗种子，每组培养基接种20瓶。培养条件：温度为25 ℃左右，每天光照时间10 h～12 h.研究不同培养基对黑果枸杞种子萌发的影响。

1.2.2 愈伤组织诱导

将无菌苗接种到MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L和MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L 3种培养基中诱导愈伤组织。每瓶接种5株无菌苗，每组培养基接种20瓶，光照培养，比较诱导率，研究不同培养基对无菌苗诱导的影响。

1.2.3 增殖培养(不定芽分化培养)

取长势旺盛的愈伤组织，分割成生长状况和大小(约1 cm3)基本一致的愈伤组织团块，分别接种于不同浓度6-BA(0.2 mg/L，0.4 mg/L，0.6 mg/L)和IBA(0.1 mg/L)的增殖培养基上。每瓶接种3块愈伤组织团块，每组20瓶。光照培养，定期观察生长情况，统计芽苗的高度和平均芽数，研究不同培养基对黑果枸杞愈伤组织分化不定芽的影响。在后续的继代培养中，6-BA激素的浓度应越来越低，因为增殖苗中已经积累了较多的 6-BA.

1.2.4 生根培养

剪取株高3 cm以上的增殖苗，分别接种于不同浓度 IBA(0.3 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L)和NAA(0.2 mg/L)的生根培养基中。每瓶接种3株无根幼苗，每组20瓶，研究不同培养基对黑果枸杞生根诱导的影响。观察根系及小芽生长情况，15 d后记录生根率、平均根数、平均根长。

2 结果与分析

2.1 无菌苗培育

以黑果枸杞成熟种子为外植体，进行初代培养。将种子接种在MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L培养基上，形成的无菌苗玻璃化现象严重，有效发芽率为40%.在MS+6-BA 1.0 mg/L+GA30.5 mg/L培养基上形成的无菌苗长势好,发芽率为80%.在MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L培养基上多数没形成无菌苗，发芽率为5%.因此，诱导无菌苗的最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+GA30.5 mg/L，30 d后陆续发芽，获得无菌苗。

2.2 愈伤组织形成

将无菌苗移栽到MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L和MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L培养基上，芽苗基部很快形成愈伤组织。在细胞分裂素(6-BA)较高的培养基中形成的愈伤组织较多，在MS培养基中加入6-BA 1.0 mg/L时愈伤组织诱导效果较好，可产生大量的绿色愈伤组织，少部分无效的黄白色愈伤组织。随着6-BA浓度增高到1.5 mg/L，愈伤组织诱导率和分化率均增高，但愈伤组织玻璃化现象严重，有效不定芽数减少。6-BA浓度为0.5 mg/L时产生的愈伤组织较少、较小。

种子萌发产生的无菌苗易被诱导，短时间内开始生成愈伤组织，在切口处膨大成浅绿色瘤，呈松散粒状。随着培养时间的延长，愈伤组织大量增殖，同时颜色转变为深绿色，并开始分化出绿色不定芽点，但5周以后愈伤组织上部出现黑点，开始老化。综合结果，培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L愈伤组织的诱导率达80%，愈伤组织生长快，增殖倍数为10倍，愈伤组织呈绿色、致密团状，有很多凸起，少部分玻璃化，为本试验诱导黑果枸杞愈伤组织生长的最适宜激素配比。

2.3 增殖与继代培养

将愈伤组织转接到6-BA含量不同的MS增殖培养基上，培养40 d后愈伤组织陆续长出不定芽。随着培养基中6-BA浓度的增加，不定芽发生率也增加。培养基中6-BA浓度高于0.6 mg/L时，增殖率开始下降，且产生的不定芽多出现玻璃化现象。当培养基中6-BA质量浓度为0.4 mg/L时，增殖效果最好，产生正常的不定芽，增殖倍数为25倍。继代培养周期约为30 d，形成芽苗。在继代培养过程中，当6-BA含量逐渐降低到0.2 mg/L时，继代培养效果较好。

2.4 壮苗与不定根诱导

当芽苗长至5 cm～8 cm 时，将细弱的芽苗剪切成带1个～2个腋芽的茎段，接种到MS培养基中进行壮苗培养。3周后再选择较粗壮的芽苗接种到生根培养基上进行不定根诱导，7 d后开始生根，突出根生长点，2周后陆续发生不定根。芽苗在1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基上生根率最高，达90%，与其它培养基相比差异显著。表现为生根速率快，根系生长迅速，且根长势均匀、数量多，植株最高约5 cm，健壮，叶子肥厚，深绿色。其次是1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基，生根率达65%.1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基生根缓慢，侧根少或几乎无侧根，个别不生根，植株矮小，生长缓慢，且产生很多玻璃化苗，出现了部分黑果枸杞苗白化现象。

3 讨论

黑果枸杞种子诱导产生愈伤组织直至长成完整植株的过程几乎没有褐化现象，污染极容易被控制，玻璃化是试验中需要克服的问题。最适宜的诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，在此培养基中，随着6-BA浓度升高，愈伤组织诱导率升高；浓度大于1.5 mg/L时，玻璃化现象加重。玻璃化的发生也与培养瓶内湿度密切相关，瓶内湿度较大，在培养瓶上盖凝结成小水滴，可能提高了玻璃化的发生率。适量减少细胞分裂素，降低培养基湿度，可以减少愈伤组织玻璃化。在培养基中添加NAA明显提高了不定芽的分化率，且增殖苗颜色深绿，长势旺盛。