细菌类可直接饲用微生物在反刍动物上的应用及可能作用机制

■付文娟 王 庆梅晓明 王香萍 马艳华

（山东鹤来生物科技有限公司，山东潍坊 262605）

动物用益生菌是一类能通过改善胃肠道微生态平衡而对宿主动物产生有益影响的活的微生物，早在上世纪20年代就有在养殖动物中应用的相关报道。因益生菌或益生素定义宽泛，且容易和人用相关产品相混淆，美国食品药品管理局（FDA）和美国饲料协会（AAFCO）要求饲料生产企业统一使用可直接饲用微生物（DFM）这一概念。DFM比益生菌的定义范围要狭窄，FDA进一步将DFM定义为“活的，天然微生物”，目前在动物用益生菌相关研究论文中使用DFM这一概念的越来越普遍。由于抗生素等多种添加剂的禁用与限用及养殖中生态理念的深入，DFM在畜牧和水产中的应用越来越广泛。反刍动物因其瘤胃微生物消化的特性，在选择应用DFM菌种时与单胃动物有着明显的区别，此外养殖阶段、养殖条件、动物品种及使用目的等诸多因素也会影响DFM的使用效果。

1925年就有关于酵母菌在泌乳奶牛上应用的首篇报道，从20世纪50年代开始，酵母菌在反刍动物上应用的报道就不断增加，Renz和Koch发现每天饲喂50 g酵母培养物就能增加产奶量。经过近几十年的发展，酵母菌在反刍动物上的应用效果研究也已相对成熟，相关研究报道和综述较多。而关于细菌DFM在反刍动物上的应用起步相对较晚，近年来随着人们对细菌DFM的日益关注，相关试验报道也在不断增加，但针对细菌DFM在反刍动物上应用效果及作用机制的综述还相对较少，本文就细菌DFM对不同养殖阶段反刍动物生产性能和健康的影响进行了总结，并对可能的作用机制进行了探讨。

1 细菌DFM在幼龄反刍动物上的应用

在现代集约化养殖环境下，新生幼龄反刍动物一般在消化道微生物完全定植之前就已经和母畜分开，并需要面临一系列如断奶、接种疫苗等应激，因此易出现腹泻等问题，造成幼龄反刍动物早期发病和死亡，给反刍动物养殖带来巨大的经济损失。从现有研究报道看，应用细菌DFM有助于幼龄反刍动物减少腹泻并促进其生长发育。

从20世纪80年代开始就有关于乳酸菌在新生或应激幼龄反刍动物上应用的报道，在该阶段微生物群落正处于过渡敏感期，饲料或环境的突然改变可引起胃肠道微生物群落的改变，这个阶段饲喂乳酸菌主要是为了维持正常的肠道菌群。在幼龄反刍动物中常用的乳酸菌有乳杆菌、肠球菌、链球菌和双歧杆菌。大部分试验结果表明在幼龄反刍动物上使用乳酸菌对其生长有促进作用的，Signorini M L等[1]对15个试验的数据进行荟萃分析发现在犊牛饲粮中添加乳酸菌能降低腹泻率，Frizzo L S等[2]分别对36个和26个试验的数据进行荟萃分析，结果表明添加乳酸菌能提高犊牛体增重并改善饲料转化率。刘国仕[3]发现乳酸菌制剂能显著提高羔羊平均日增重，提高饲料报酬。当然也有少量研究表明乳酸菌的添加对反刍动物没有显示出效果，Abu-tarboush H M等[4]发现给犊牛饲喂乳酸菌，其饲料转化率没有变化。

近10年来关于芽孢杆菌在反刍动物上应用效果的研究越来越多，主要集中在枯草和地衣芽孢杆菌。就现有文献来看，芽孢杆菌在幼龄反刍动物上的应用效果大部分都是正面的，张海涛等[5]发现纳豆枯草芽孢杆菌能促进荷斯坦犊牛瘤胃发育。符运勤[6]认为地衣芽孢杆菌可促进0～8周犊牛的平均日增重。郭云霞等[7]证实在断奶羔羊精料中添加枯草芽孢杆菌能显著提高饲料消化率和生长性能并降低腹泻率，崔一喆等[8-9]在离乳马鹿和离乳梅花鹿中也得到了类似的结果。也有试验表明芽孢杆菌对犊牛生长性能的改善没有效果，Riddell J B等[10]发现饲喂枯草和地衣芽孢杆菌对犊牛的干物质采食量、平均日增重和饲料转化率均没有改善作用。

2 细菌DFM在奶用反刍动物上的应用

对于高产奶用反刍动物而言，泌乳早期是使用细菌DFM的最佳时期，因为此阶段反刍动物一般处于能量负平衡，而且饲喂的一般是高精料饲粮容易引起瘤胃酸中毒[11]。在奶用反刍动物上使用较多的细菌DFM主要有乳酸菌、丙酸杆菌和纳豆枯草芽孢杆菌，埃氏巨型球菌也有少量应用。综合现有文献来看，细菌DFM对奶用反刍动物产奶量的影响大部分是正效应，而对奶组分的影响并不一致。Jaquette R D等[12]发现给泌乳奶牛饲喂嗜酸乳杆菌可将产奶量提高1.8 kg/d，干物质采食量、乳脂肪和乳蛋白含量不受影响。Lehlpenya K V[13]的研究表明，给泌乳奶牛饲喂丙酸杆菌，产奶量、干物质校正乳和4%脂肪校正乳分别提高2.7、0.9 kg/d和1.6 kg/d。West J W等[14]发现，在泌乳奶牛饲粮中同时添加嗜酸乳杆菌和丙酸杆菌，产奶量增加6.96%。Raeth-knight M L等[15]进行了相似的试验，但是DFM对奶牛产奶量、干物质采食量、饲粮消化率和瘤胃发酵没有发现影响。Peng H等[16]向36头泌乳奶牛饲粮中添加不同剂量的纳豆枯草芽孢杆菌，饲喂9周后发现纳豆枯草芽孢杆菌的添加对干物质采食量无影响，但能提高产奶量和饲料转化率（P＜0.05），对乳脂率和乳蛋白产量无影响，但增加了乳脂产量（P＜0.05）和乳糖含量（P＜0.01）。

3 细菌DFM在肉用反刍动物上的应用

研究表明在肉用反刍动物中添加细菌DFM能提高其饲料转化率和日增重，并对胴体品质有一定的改善效果，不过这些益生效果并不总是一致的。在肉用反刍动物上应用较多的细菌DFM有乳酸菌和丙酸杆菌，芽孢杆菌和埃氏巨型球菌也有部分应用。Krehbiel C R等[17]通过对多个试验的数据结果进行总结发现，在肉牛饲粮中添加不同比例的嗜酸乳杆菌+丙酸杆菌可将日增重提高2.5%～5%，饲料转化率改善近2%，胴体质量一般能增加6～7 kg，采食量数据不一致。张晓勇[18]发现在绵羊饲粮中添加植物乳杆菌可显著提高其采食量和营养物质消化率。Brashears M M等[19]在肉牛饲粮中添加嗜酸乳杆菌NPC747，结果表明体增重、采食量和肉料比与对照组没有区别。Elam N A等[20]发现在育肥肉牛日粮中添加嗜酸乳杆菌和费氏丙酸杆菌对其生产性能和胴体品质没有任何影响。刘国仕[3]发现枯草芽孢杆菌能显著提高羔羊日增重，并提高羔羊的屠宰率（胴体重、净肉重和骨重）。贾鹏等[21]发现在杜寒杂交肉羊饲粮中添加地衣芽孢杆菌对其采食量、体增重没有显著性影响，不过能显著降低料重比。

4 细菌DFM在反刍动物上可能的作用机制

综上可知反刍动物对细菌DFM会有各种不同的应答，某些外在因素如菌种的选择、动物的生理状态、基础饲粮的类型、饲养管理水平等因素都会影响细菌DFM的使用效果，但内在的作用机制是其能否起作用的关键，因此非常有必要探究其中所涉及的潜在机制。

4.1 对瘤胃和肠道发育的影响

Zhang H T等[22]发现给断奶后犊牛饲喂纳豆枯草芽孢杆菌处理组瘤胃乳头密度和乳头表面积高于对照组，瘤胃上皮发育好于对照；在其另一篇报道中发现犊牛饲喂纳豆枯草芽孢杆菌后，其小肠的长度、盲肠和结肠的重量均大于对照组，从而可能使得犊牛体内纤维得到了更好的消化。贾鹏等[21]发现在杜寒杂交肉羊饲粮中添加地衣芽孢杆菌能显著提高瘤胃和小肠重量。由此说明芽孢杆菌可能能促进瘤胃上皮及肠道的发育。张海涛等[23]认为纳豆枯草芽孢杆菌对瘤胃发育的促进作用可能与瘤胃上皮细胞对丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸的吸收增加有关。而肠道的发育也可能与短链脂肪酸有关，王丽凤[24]发现乳酸菌能促进肠道菌群增殖，肠道微生物经发酵产生的短链脂肪酸能通过提供给肠黏膜能量，改善组织局部供血，进而促进肠上皮细胞的修复以及提高胰液中胰酶的分泌来促进肠道的发育。此外细菌DFM对瘤胃发育的影响可能也与瘤胃菌群的建立有关。Yu P等[25]发现添加纳豆枯草芽孢杆菌改变了断奶后瘤胃细菌群落结构，能促进犊牛瘤胃微生物区系的建立，促进纤维降解菌的定植和生长，处理组中主要的纤维分解菌16SrDNA拷贝数是对照组的3倍。

4.2 对瘤胃发酵的影响

4.2.1 影响瘤胃pH值

瘤胃液pH值的稳定对于维持反刍动物瘤胃内环境的稳态及瘤胃微生物的生长起着关键的作用。瘤胃pH值的下降引起乳酸在瘤胃内的积累，影响瘤胃内微生物的生长，导致瘤胃内微生物菌群失调，容易诱发瘤胃酸中毒，影响瘤胃壁的完整性及动物健康。目前反刍动物养殖过程中大部分使用的是高精料饲粮，易引起瘤胃酸中毒，而使用细菌DFM被证明是目前缓解瘤胃酸中毒的有效手段之一。

埃氏巨型球菌是瘤胃中主要的乳酸盐利用菌，能同时利用乳酸盐、葡萄糖和麦芽糖，并与乳酸盐产生菌竞争底物，可通过有效利用瘤胃内的乳酸盐来维持瘤胃pH值：Greening R C等[26]报道当给肉牛饲喂高精料饲粮时，瘤胃会积聚大量的乳酸盐，巨型埃氏球菌通过快速利用乳酸盐可防止pH值急剧下降或急性酸中毒的发生。丙酸杆菌虽然在瘤胃内以产丙酸盐为主要任务，但也可作为瘤胃内的乳酸盐利用菌：Gilchrist M J等[27]报道绵羊在适应高精料饲粮时，丙酸杆菌对乳酸盐的利用能占到总量的40%～50%。还有研究表明丙酸杆菌也能通过促进原虫的生长（尤其是内毛虫），降低瘤胃中淀粉分解菌的数量，对稳定瘤胃pH值起到一定的功效。此外乳酸菌对于维持瘤胃pH值的稳定，缓解瘤胃酸中毒可能也有一定的有益影响，Van Koevering M T等[28]表明饲喂嗜酸乳杆菌能降低肉牛瘤胃中D-乳酸盐和总乳酸盐的浓度。Huffman R P等[29]发现在诱导发生亚急性酸中毒的公肉牛饲粮中添加嗜酸乳杆菌能降低瘤胃pH值在6以下的时间。Yoon I K等[30]表明这种益生作用可能与乳酸菌能使瘤胃微生物快速适应乳酸的存在，并促进乳酸盐利用菌的增殖有关，具体机制还有待进一步的研究。关于芽孢杆菌降低瘤胃pH值的报道不太一致，大部分研究表明芽孢杆菌对降低瘤胃pH值没有效果。4.2.2 影响挥发性脂肪酸的产量

研究表明在反刍动物饲粮中添加细菌DFM可提高挥发性脂肪酸浓度，但对各种挥发性脂肪酸浓度提高效果不一样。Sun P等[31]在奶牛日粮中添加纳豆枯草芽孢杆菌固体发酵物后，丙酸、戊酸及总挥发性脂肪酸产量显著升高，乙酸及乙酸/丙酸显著降低。邓露芳[32]研究表明反刍动物日粮中添加纳豆枯草芽孢杆菌后，乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度分别提高了10.43%、50.35%和20.70%（P＜0.05）。其在体外人工瘤胃发酵试验中发现，纳豆枯草芽孢杆菌处理组挥发性脂肪酸各指标均有不同程度的提高，乙酸、丙酸、丁酸和挥发性脂肪酸总量分别提高6.52%、1.96%、11.02%和5.77%（P＜0.05）。挥发性脂肪酸浓度的增加可能因为芽孢杆菌通过自身分泌的胞外酶或者通过增加瘤胃细菌的数量提高了饲料消化利用率。Hosoi T等[33]表明芽孢杆菌能分泌复杂的纤维素酶、淀粉酶等胞外酶系，可促进营养物的消化吸收。Deng L F和邓露芳[32，34]在奶牛饲粮中添加纳豆枯草芽孢杆菌可增加纤维分解菌（溶纤维丁酸弧菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌和淀粉分解菌（牛链球菌和嗜淀粉瘤胃杆菌）数量，普雷沃氏菌数量也显著提高。

瘤胃中碳水化合物发酵的主要产物是乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，它们是反刍动物主要的能量来源及合成乳脂肪和体脂肪的原料，因此挥发性脂肪酸的浓度将会直接影响泌乳奶牛产奶量及乳成分产量。除了影响产奶量和乳成分，在前面已经提到反刍动物瘤胃和肠道的发育可能也与产生的挥发性脂肪酸有关。此外张海涛等[23]也发现芽孢杆菌也可能通过影响瘤胃中挥发性脂肪酸的产量改变瘤胃渗透压最终促进犊牛的采食量，而Baile C A等[35]提出瘤胃壁的丙酸受体有调控采食量的功能，Oba M等[36]和Weiss W P等[37]发现在瘤胃灌注丙酸及饲喂丙酸菌增加了瘤胃内丙酸进而降低了采食量，Allen M S等[38]发现增加的丙酸浓度对采食量的影响与体内葡萄糖需求相关。

4.2.3 影响氨态氮浓度

瘤胃中氨态氮是反应瘤胃代谢水平的重要指标，通过测定瘤胃中氨态氮浓度可间接反应瘤胃微生物分解饲料粗蛋白产生氨氮和利用氨氮合成微生物蛋白的平衡情况，其浓度与日粮降解氮对微生物氮的转化效率呈负相关。目前有关细菌DFM对瘤胃氨态氮浓度的研究资料比较匮乏，而且研究结果也不太一致。乔国华等[39]发现地衣芽孢杆菌能够降低瘤胃内氨态氮浓度，通过增加瘤胃内细菌数可提高瘤胃微生物对氨的利用，而枯草芽孢杆菌则没有这种效果。邓露芳[32]和Sun[31]都发现用纳豆枯草芽孢杆菌饲喂奶牛时，瘤胃液中氨态氮浓度增加，氨态氮浓度增加可能与瘤胃内原虫数量提高有关，瘤胃原虫对细菌的吞食作用是降低瘤胃微生物蛋白合成的重要因素。Ghorbani G R等[40]在奶牛日粮中添加丙酸杆菌，瘤胃内原虫数量增加，加速了瘤胃内细菌的氮循环，提高了瘤胃中氨氮浓度。就现有研究资料来看，菌种的选择对瘤胃氮代谢的影响较大，具体机制还有待进一步研究。

4.2.4 影响甲烷产量

对反刍动物而言，甲烷菌通过种间氢转移产生甲烷来维持瘤胃中正常的氢分压，使微生物对底物的发酵顺利进行，从而保证反刍动物对营养物质的有效吸收和利用，但与此同时反刍动物因瘤胃甲烷的产生而损失的能量可达到饲料总能的2%～15%，极大幅度降低了反刍动物的饲料利用率。目前有关通过添加细菌DFM来控制甲烷产生的报道相对较少，肖怡[41]发现添加地衣芽孢杆菌可在一定程度上降低肉羊的甲烷排放量，通过实时定量PCR对试验羊瘤胃中的甲烷菌进行绝对定量发现可能因为直接减少了甲烷菌和原虫的数目，从而减少甲烷排放量。乔国华等[39]发现在反刍动物饲粮中添加地衣芽孢杆菌可显著降低甲烷产量，但是枯草芽孢杆菌和蜡样芽胞杆菌组则差异不显著，地衣芽孢杆菌组甲烷产量的降低可能因为甲烷菌的生长受到了抑制。Ellis J L等[42]在奶牛日粮中添加乳酸菌，结果表明当日粮的底物不同时，对奶牛甲烷的产量各不相同。由此可见使用的菌种和饲粮类型对甲烷产量都有影响。此外研究发现甲烷的产量可能还与瘤胃中挥发性脂肪酸浓度及比例有关，甲烷的生成量与乙酸比例呈正相关，与丙酸比例呈负相关，当瘤胃发酵产生乙酸/丙酸为0.5时，不产生甲烷，当发酵全部生成乙酸时，以甲烷形式损失的能量约为33%[43]。Ghorbani G R等[40]发现反刍动物饲粮中添加的丙酸杆菌能够降低甲烷产量，对于改善能量利用率有一定的效果，可能因为丙酸杆菌的添加促进了瘤胃内丙酸盐的产生，降低了乙酸/丙酸比例。

4.2.5 肠道菌群与机体免疫

经过瘤胃进入小肠内的细菌也会对肠道内的菌群产生有益影响，Tabe E S J等[44]发现在育肥牛饲粮中添加嗜酸乳杆菌能将粪便中脱落的E.coliO157∶H7降低32%。Brashears M M等[19]发现添加乳酸菌能降低肉牛粪便中脱落的E.coliO157∶H7并减少对牛皮的污染。Hosoi T等[33]发现纳豆枯草芽孢杆菌能促进乳酸杆菌的生长和活性，Osawa R[45]、贾力敏[46]、陈兵等[47]证实纳豆枯草芽孢杆菌能抑制致病菌生长。纳豆枯草芽孢杆菌的抑菌特性可能与其分泌产生的抗菌素杆菌肽，多粘菌素和2,6-吡啶二羧酸有关。乳酸菌对肠道菌群产生的有益影响可能与以下两个机制有关[48-49]：①乳酸菌可在肠道形成生物屏障，竞争性排除病原菌；②乳酸菌能产生对病原体具有拮抗作用的化学物如有机酸，过氧化氢，小分子抑菌化合物（罗伊菌素）和抗菌肽（细菌素）等。有关细菌对反刍动物免疫功能的影响相对较少，梁晋琼等[50]发现枯草芽孢杆菌活菌制剂具有治疗犊牛和生产奶牛细菌性肠道疾病的作用，同时具有治疗和预防羔羊细菌性肠道疾病的作用。Sun P等[51]的研究表明奶牛日粮中添加纳豆枯草芽孢杆菌，能显著增加IgG和细胞因子IFN-γ的分泌，有利于激活免疫系统，提高机体免疫力。杨华等[52]发现在肉羊饲粮中添加芽孢杆菌和双歧杆菌可显著性提高脾脏指数、IgG和IL-6含量，有利于提高肉羊的免疫功能。Roos T B等[53]发现蜡样芽胞杆菌能提高绵羊体液免疫。

5 结语

细菌DFM对不同养殖阶段反刍动物的生产性能和健康均具有显著的改善效果，作为一种天然绿色的饲料添加剂，细菌DFM在反刍动物养殖上将会有广阔的应用前景，但在实际生产中细菌DFM的选用应综合考虑反刍动物的饲粮类型、饲粮处理方式、动物生长阶段、动物生理状况等，在使用细菌DFM时也应充分考虑菌种种类、组合方式、添加剂量等。目前关于细菌DFM对反刍动物瘤胃的影响机制资料较少，在将来的研究中，尚需进一步揭示细菌DFM与瘤胃发育、瘤胃营养物质消化率、瘤胃微生物菌群平衡、瘤胃能量代谢等方面的相互作用；针对细菌DFM对瘤胃后胃肠道作用机制方面的研究，目前已有的数据主要是针对体外细胞或在其他动物上的研究结果，因此有必要开展与反刍动物相关的肠道有害菌群及动物免疫方面的工作；以上研究对于深入了解细菌DFM的作用机制，开发新的对反刍动物更有效的细菌DFM产品具有重要的理论指导意义。