单细胞分析技术在肿瘤研究中的应用进展

戴曦 宋琦 梁丽娴

1西南医科大学附属医院（四川泸州646000）；2澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室/澳门药物及健康应用研究院（澳门特别行政区999078）

在世界范围内每年大约有1 600 多万例患者死于肿瘤，其中亚洲和欧洲就贡献了约73%的人口，中国大约占25%［1-2］。美国每年大约有168 万新发癌症病例和59 万因癌症导致的死亡病例，紧随心血管疾病之后，癌症亦成为美国第二位死亡原因［3］。在欧洲，有数据报道每年癌症的发病率和病死率分别是345 万和175 万，女性乳腺癌、肺癌、结直肠癌和前列腺癌是欧洲发病率最高的4 种癌症类型［4］。由此可见，肿瘤因其高发病率和高致死率，导致了巨大的社会经济负担。尽管有更先进的成像、诊断技术的出现和不断发展的靶向药物，癌症所带来的威胁仍在与日俱增，因此，更深入探索和了解肿瘤机制，优化诊治方案是目前亟待解决的问题之一。

1 单细胞生物技术在肿瘤研究中的应用意义

在过去，细胞个体特征与群体特征的一致性是被广泛接受的一个概念，在这一观点的引导下，学者们一直关注于肿瘤宏观水平的研究而非肿瘤细胞个体。然而，近年的研究逐步揭示出单个细胞的个体特性是明显有别于整体的［5-6］。肿瘤的发展是基于单个肿瘤细胞的自体扩增、随机突变以及自我筛选形成相对独立的亚群，这些亚群之间又互相影响成为密不可分的整体发展［7］。在宿主环境中，恶性细胞除了将遗传模板传递给下一代以外，还在适应过程中不断自我改造，使得遗传信息出现适应性修饰改变成为必然，其结果是组成整体的个体之间逐渐呈现出不同程度的差异，最终导致不同患者对相同治疗出现不同应答，治疗效果千差万别。因此将研究深入到单细胞水平，而不再固守于传统的整体宏观研究，极大提高了科研工作者对肿瘤细胞异质性和患者个体性的认识，逐渐揭示出在整个肿瘤生态体系中，肿瘤细胞个体是如何感知、回应并适应肿瘤微环境的，并且肿瘤细胞个体的异质性又是如何出现并最终影响肿瘤整体的命运［8］。成批量的分析肿瘤整体的特性仅仅是得到该细胞种群的平均数据，而那些重要的肿瘤细胞亚群信息却被无意中隐藏了起来；相反，如果对亚群中代表性的单个细胞进行分析，就能得到丰富而准确的细节信息，了解患者个体差异，从而在肿瘤治疗中指导临床决策和个体化用药，最终通过精准治疗使患者获益［9］。

2 单个肿瘤细胞的分离技术研究进展

从肿瘤患者体内直接取得的标本是混杂的肿瘤细胞群，或肿瘤细胞与间质细胞的混杂，运用传统宏观分析得到的结果是该细胞群平均值，必然存在干扰因素的掺杂，导致研究结果出现偏差。因此需要从单细胞水平对肿瘤进行，其首要前提是实现单个肿瘤细胞的分离。如何从肿瘤患者标本中精确获得高通量数据，同时在单个肿瘤细胞采集过程中细胞的遗传生理特性不受影响是目前面临的最大挑战［10］。目前单个细胞的分离技术主要有：（1）细胞显微操作技术。在可视下通过细胞显微操纵器手动筛选所需细胞，可控性高。现亦运用于细菌筛选、人辅助生殖技术等技术领域［11］。（2）红外线切割技术。将患者的肿瘤组织切片置于显微镜下，利用高强度激光束在可视下切割单个肿瘤细胞，切割过程不会对细胞造成任何伤害或污染，但对操作技术有较高要求［12］。（3）流式细胞术。将患者标本中的细胞群处理后在超声波和流体力学作用下形成有序的单个细胞队列并快速通过激光束，细胞上被激光激发的光学信号被光学探测器捕获，根据细胞大小、形态、自发荧光或标记荧光、荧光标记抗体或染色等理化性质的不同实现对患者血液细胞的分选、分析、鉴定和诊断。目前只有流式细胞术真正实现了高通量高效能的细胞分离筛选，根据细胞类型和应用程序的不同，细胞筛选能达到数百到数千个/秒不等，在免疫表型、细胞周期、凋亡、亚种群、肿瘤诊断等领域都得到了广泛运用。但是在分选过程中细胞的生理特性受到流体压力、激光刺激、静电压等因素的影响，难以利用分选细胞进一步研究分析［13］。（4）免疫磁珠分离技术。这类技术利用特异性抗原抗体反应将标记有特殊抗体的磁珠目标肿瘤细胞结合在一起，在磁场作用下与磁珠结合的肿瘤细胞被吸附实现单个细胞分离。这种技术已被成熟运用于临床循环肿瘤细胞的检测当中，也能避免肿瘤细胞在捕获过程中的损伤。（5）微流体装置。又被称为“芯片上的实验室”，这种生物芯片上特殊设计的通道直径仅容少量细胞通过，通过对流体压力的平衡调节将目标肿瘤细胞捕获并固定在可视区域内，通过进一步的处理可以实现在短时间内动态观察并测量肿瘤细胞的各项生理参数。当前的微流体装置实现了单细胞分离和分析的一体化，具有污染少、耗材少、对细胞物理损伤小等优势［14-15］。

3 单细胞分析技术在肿瘤研究中的应用进展

肿瘤细胞在生长分裂过程中不断累积新的突变，进而成为不同的克隆亚型并最终形成肿瘤包块，与之同步的是肿瘤细胞DNA 持续的损伤修复过程和基因的不断丢失。这意味着单个肿瘤细胞之间在基因组序列及表型上存在差异，这种异质性最终对治疗和预后产生关键性的影响。对于实体肿瘤来说，细胞异质性、分子间差异以及微环境的复杂性是临床工作中对肿瘤进行分类、诊断和治疗的一大障碍，而单细胞水平的分析恰好解决了以上问题，通过揭示信号通路相互之间的抑制或激活关系、遗传信息的随机波动，让我们真正能从单克隆水平了解肿瘤的发生发展、转移侵袭等，在分子水平上揭示肿瘤相关机制。目前技术已经实现了单个细胞水平的基因组学分析、转录组学分析以及蛋白组学分析，这些技术帮助我们理解单个肿瘤细胞基因表型与功能之间的关系，肿瘤细胞的异质性同以及宏大的遗传多样性［16］。

3.1 单细胞基因组学和转录组学研究进展 通常单个细胞的基因组DNA 含量约在pg～μg 水平，RNA 含量在pg～ng 水平，其中真正携带遗传信息的mRNA 仅占10%左右，因此扩增是单细胞基因组学、转录组学研究的首要关键，如何减少基因片段丢失、扩增偏倚、突变、嵌合和污染，提高扩增效率和纯度，覆盖单细胞的全基因组是目前单细胞基因组学和转录组学研究所面临的共同问题［17-18］。传统PCR 全基因组扩增技术（WGA）由于其原理是非线性的随机基因配对而很容易出现误差，改良的MDA 法和MALBAC 等技术更好地覆盖了全基因组，降低了配对误差［19］。另一方面Tang′s method、Smart-seq、STRT-seq、CEL-seq、Drop-seq、Cyto-seq 等多种技术被发明并应用于单细胞转录组学的扩增和分析，这些方法在转录完整性、定位误差、结合特异性以及兼容性等方面各有特色，能将单个肿瘤细胞通过微滴实现分离包裹，在微滴中完成裂解和逆转录，再通过特殊设计的磁珠收集逆转录产物并进一步分析筛选［20-23］。通过对肿瘤的基因突变检测以及全基因测序分析，目前发现了更多肿瘤相关性基因突变，为临床诊治和科研提供更多方法和证据。

3.2 单细胞蛋白组学研究进展 单细胞蛋白免疫印迹技术是利用标记的抗原抗体反应对肿瘤细胞群进行分类筛选，或直接检测单个肿瘤细胞中特定蛋白的表达水平。该技术实现了对单个肿瘤细胞的蛋白组学分析。这种方法可以将单个肿瘤细胞放进直径为20 μm 的凝胶微孔中原位裂解并电泳，在0.5 mm 长的凝胶上经过抗原抗体反应和发光显像，单个细胞的目标蛋白表达水平就能被检测到［24-25］。通过对单细胞分析技术的运用，BENDALL 同时检测了人骨髓中单细胞的34 项参数，并由此绘制出药物反应相关的细胞信号应答图谱［26-27］；有些微流体装置还实现了100%纯度的高通量筛选分离循环肿瘤细胞，并利用该技术完成了临床循环肿瘤标本的EGFR 突变分析［28］。可以说，单细胞分析技术正让我们面临一场肿瘤治疗的新革命。

4 微流体单细胞生物芯片分析仪在耐药肺癌患者中的临床应用

化疗仍然是晚期肺癌患者的首选治疗方案，然而化疗药物的耐药性，尤其是多重耐药（multidrug resistance，MDR）往往难以避免［29］。耐药的机制复杂，一方面是由于肿瘤细胞膜药物转运蛋白的过表达或过度激活，这类ATP链接转运蛋白（P-gp，MRP1）具有跨膜域结构，扮演着肿瘤细胞保护者角色，将大量药物转运出细胞导致临床耐药和治疗失败［30-32］。另一方面则是由于肿瘤细胞药物解毒酶系统的过表达。以谷硫磷转移酶为代表的这类酶系统在肿瘤细胞中显著高表达，参与异种生物的解毒，导致胞内药物降解，降低细胞毒性，与肿瘤治疗反应密切相关［33］。另外，研究发现了许多非编码小分子RNA 通过突变基因的表达参与表观遗传调控，从而导致MDR［34］。在临床诊治中检测患者是否耐药，提前根据患者肿瘤细胞特征选择敏感性化疗药物以避免无效治疗、减轻患者痛苦，是治疗肺癌的关键课题之一，微流体单细胞生物芯片分析技术恰好能解决这个问题。

微流体单细胞生物芯片分析技术是利用微流控芯片装置在显微镜下捕获单个细胞并对其进行观察检测的新技术，它包括一个观察装置（带有激光的显微镜，同时能实现将光学信号转换并传递到计算机），3D 打印微流控生物芯片（细胞流控和捕获平台）以及数据分析软件。其微流控芯片同时设计有多个通道控制药物的进出，通过检测标记在药物上的荧光信号并将信号传输到分析软件中进行分析，借此了解药物与目标细胞的相互作用。首先，笔者采用磁珠分选技术提取患者血液、胸水等标本中的肺癌细胞，通过肿瘤细胞计数评估患者病情。紧接着这些筛选分离得到的细胞被固定在微流控芯片的特定位置，通过检测目标细胞内药物聚集水平就可以预先评估该患者对药物的敏感性如何，从而指导个体化临床化疗方案的制定。其次，微流体单细胞生物芯片分析仪也是本实验室筛选新的有效抗癌药物的良好工具，甚至是筛选能够逆转肺癌MDR 的新的药物。这些研究借助单细胞分析平台揭开了更多肺癌的面具，使得临床转化获益。

5 单细胞分析技术在肿瘤研究中的应用挑战与展望

单细胞分析技术作为快速发展的前沿科技，在生命科学发展中扮演了极为重要的角色，它揭示了细胞个体是如何感知、回应并适应群体并最终决定群体的命运，帮助我们深入了解肿瘤发生、发展过程，评估患者病情，指导临床治疗。当然，这项技术在许多方面还有很大的提升空间，例如高通量的筛选细胞同时避免污染减少细胞损伤；提高基因组学、转录组学扩增的完整性同时减少配对偏倚；根据个体的异质性更好地评估群体发展趋势等等。单细胞分析技术是近年来关注的焦点，我们有理由相信这一领域正在蓬勃发展并将促进更多相关领域技术的发展，最终推动医疗的进步。