DNA甲基化生物学特征及其在胚胎、生殖细胞发育、衰老中的变化研究进展

孟燕,乔杰

(北京大学第三医院 ，北京100083)

衰老是人类生活中自然而渐进的过程，主要表现为组织功能的逐渐减退，它受遗传、环境、生活方式、疾病等多种因素的影响。机体衰老是细胞衰老的结果,而细胞衰老是DNA维持、修复、控制过程异常的结果。DNA甲基化是衰老过程中研究最深入的表观遗传修饰之一。近年来，随DNA甲基化检测技术特别是全基因组定量法的普及，DNA甲基化形成、DNA去甲基化以及DNA甲基化的作用机制等已逐渐明确。DNA甲基化与年龄的关系通常被归类为“表观遗传漂变”现象，其特征是基因组的逐渐广泛去甲基化和基因特异启动子相关的CpG岛(CGIs)的超甲基化[1]。表观遗传修饰是指基因碱基序列不发生改变，但基因表达发生了可遗传性改变的调控方式[2]。表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控及染色体空间结构调控等。DNA甲基化是最早发现、最重要的基因表观修饰方式之一，动物组织DNA甲基化主要发生在CpG位点上。Cp甲基化是通过DNA甲基转移酶 (DNA methyltransferases，Dnmts)将甲基基团转移到 DNA 胞嘧啶残基上的过程[3]。DNA甲基化在调控基因表达、染色体结构维持、X染色体失活和基因组印迹中起重要作用[4]。现将DNA甲基化的生物学特征，及其在胚胎、生殖细胞发育和与衰老相关的模式的研究进展综述如下。

1 DNA甲基化的生物学特征

1.1 DNMTs DNMTs是保守的催化序列，在DNA甲基化中起着关键性的作用。它催化甲基产生5-甲基胞嘧啶，然后添加在DNA的CG二核苷酸的胞嘧啶上。哺乳动物组织中有四种DNMTs：DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L。DNMT1 作用于仅有一条甲基化链的DNA双链，催化甲基转移到新合成的DNA链上, 使其完全甲基化，此现象称为维持甲基化; 而 DNMT3A和DNMT3B则催化新的甲基化位点发生反应, 称为从头甲基化。通过DNMTs的催化, DNA 甲基化才得以完成。

Yin 等[5]研究发现， DNMT1 、 DNMT3A在人类绒毛和蜕膜组织中表达, 当胚胎中DNA维持甲基化受到抑制时, 胚胎着床率降低, 胎儿流产的风险增加。这说明胚胎的着床与发育异常可能与胚胎中 DNA 维持甲基化缺陷有关。 晁远等[6]研究结果显示, DNMT1、DNMT3A mRNA在自然流产绒毛组织中的表达量明显低于人工流产绒毛组, 且二组DNMT3B mRNA的表达量间差异无统计学意义,说明DNMT1、DNMT3A mRNA表达下调可能是造成绒毛中DNA甲基化不足的原因。DNMT1、DNMT3A 表达降低可能是自然流产的一种独立诱发因素。

1.2 CpG岛 DNA中的5-甲基胞嘧啶(5 mC)被称之为人类DNA的第5种碱基，约占基因组碱基的1%。哺乳动物中CpG以两种形式存在：一种分散于DNA序列中；另一种呈现高度聚集状态，称之为CpG岛(CGIs)。CGIs指大于500个碱基对，且GC二核苷酸占50%以上DNA序列，60% CpG岛位于基因启动子区域， 其内的CpG通常是非甲基化的，从而允许相关基因转录[7]。而大部分分散的CpG是甲基化的。相反，位于基因体的甲基化CpG二核苷酸不影响基因转录，但是可能会阻碍启动子的激活[8]。余下40%的CGIs位于基因间和基因内区域，因与启动子无关而被定义为“孤儿CGIs”[9]。离启动子CGIs至少2 kb处的CpGs密度较低(CGI约1/10)，被定义为CGI海岸，它们也参与基因表达的调控。CGI海岸经常与组织特异性差异甲基化区域(DMRS)在正常组织中重叠[10]。

1.3 DNA去甲级化 DNA去甲基化包括主动去甲基化和被动去甲基化。

被动去甲基化是细胞通过抑制DNMT1表达来阻断DNA甲基化维持，在细胞分裂过程中稀释基因组中甲基化胞嘧啶的浓度，实现被动去甲基化。据报道[11]这种被动去甲基化机制是小鼠胚胎发育过程中原始生殖细胞去除基因组亲本DNA甲基化的关键机制。[4]主动去甲基化是通过生物酶改变胞嘧啶上的甲基化修饰，可直接去除胞嘧啶上的甲基化，也可对甲基化进行修饰而导致胞嘧啶的改变。参与这一系列反应的是一组酶—TET蛋白。TET蛋白家族有三个成员，分别是TET1、TET2、TET3。TET蛋白可以将5 mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5 hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)等一系列修饰形式。而胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)触发碱基修复(BER)过程，将5fC和5caC修复为未甲基化胞嘧啶。AID/APOBEC(活化诱导脱氨酶/载脂蛋白B编辑复合物)酶可能涉及5 mC和5 hmC脱氨过程中，将5 mC和5 hmC脱氨基形成胸腺嘧啶和5-羟甲基尿嘧啶(5hmU)，然后通过BER/TDG活性从DNA中除去[12]。然而，大量的研究发现，5 hmC不仅仅是去甲基化的中间产物，它可以作为稳定的表观遗传信号，因此，和 5 mC类似， 5 hmC 被认为是DNA的额外碱基[13]。然而， 5 hmC 水平在不同类型的细胞和组织中差异很大，含量最高的为中枢神经系统(CNS)[14]。在大脑中， 5 hmC在转录起始位点和主动转录基因的基因体上富集。更特异的是， 5 hmC 位于基因外显子-内含子交界处。另外，5 hmC 也位于转录调控元件的侧翼区域，如增强子/沉默子和转录因子结合位点。类似的模式发生在CGIs上，其中5 hmC位于它们的边界。但是，在重复序列中(例如SINE、LINE、LTR和卫星DNA)5 hmC的含量是低的[13]。5 hmC 作用机制尚不完全清楚，但是有研究显示 5 hmC 的定位受DNA序列和染色体表观遗传蛋白因子的影响[15]，从而推测该表观遗传信号影响染色质结构和功能是合理的。例如，大脑中5 hmC由是MeCP2识别和结合，与转录功能有关[16]。关于5fC和5caC，由于它们在哺乳动物基因组中及其稀少，从而限制了我们对它们功能的认识。但是，一些研究[17]表明，这些去甲基化中间产物在哺乳动物基因组中是稳定的，这为我们进一步研究其去甲基化之外的功能创造了条件。

2 DNA甲基化在胚胎、生殖细胞发育及衰老中的变化

DNA甲基化的变化从受孕开始，发生在整个生命过程。人类早期胚胎发育过程中，经历两次大规模的DNA甲基化重编程，即整体范围的去甲基化和重新甲基化，分别发生在早期胚胎发育阶段和配子形成阶段。环境、生活方式、营养等会影响DNA甲基化的模式。大多数组织的平均DNA甲基化水平在生命早期增加，随着年龄的增长而逐渐降低。

2.1 DNA甲基化在胚胎发育、生殖细胞发育过程中的变化 小鼠的早期胚胎发育过程中经历了整体范围的去甲基化和重新甲基化过程．小鼠精子的平均甲基化水平约为 80%，卵细胞约为 50%，在受精后3.5 天左右的内细胞团(ICM) 时期， 甲基化水平降至最低，约为20%。胚胎从ICM 发育到 7.5 天左右，发生了整体范围的重新甲基化，平均甲基化水平达到 73%[18]。近期在人早期胚胎发育的研究[19]中发现，人类与小鼠及其他哺乳动物的早期胚胎 DNA 甲基化动态非常相似。大体遵循着生殖细胞高甲基化、胚胎低甲基化；合子中亲本的甲基化信息被大规模消除并重建的过程。在早期胚胎大规模去甲基化的过程中，部分区域仍然维持了生殖细胞中的甲基化水平，这些区域主要是印迹调控区(imprinting control regions，ICR)。ICR 可以被划分为生殖细胞印迹调控区(germ-lineICRs, gICRs)和体细胞印迹调控区(somatic ICRs， sICRs)[20]。gICR 指在精子和卵子中就建立的等位基因组序列的差异甲基化区域，并且gICR 在早期发育过程中不发生DNA 的去甲基化；而 sICR 是指只在体细胞中才建立起的等位基因组序列的差异甲基化区域[21]。哺乳动物早期胚胎的 去甲基化过程是区域特异性的，在此过程中许多区 域被保护并不去甲基化，从而使一些父源和母源差 异的甲基化区域(印迹区域)能够维持下来，因此我 们推测选择性地去甲基化方式可能是导致印迹基因形成的一个重要因素[18]。

生殖细胞发育过程中全基因组去甲基化及重新建立DNA甲基化图谱。原始生殖细胞(primordial germ cells， PGCs)是能够产生雄性和雌性生殖细胞的早期细胞。生殖细胞发育过程中经历了全基因组的去甲基化及重新建立DNA甲基化图谱的过程。在小鼠的PGC发育过程中，发生了大规模的去甲基化过程。PGC在 6.5天时起始分化，在13.5天时，平均甲基化水平降至最低点，此时全基因组 DNA 的甲基化水平大约在 5%左右[18]。雄性的PGC细胞在13.5 天后开始重新建立甲基化图谱，而雌性PGC重新甲基化的时间晚于雄性．经过重新甲基化后，雄性生殖细胞的甲基化水平高于雌性生殖细胞，从而形成精子和卵子。人与小鼠的PGC发育过程 DNA 甲基化动态非常相似。由于发育周期不同，人妊娠10～11 周时，PGC的甲基化水平降至最低点，随后进入重新甲基化过程[22]。研究[23]发现一部分与代谢和神经性疾病相关的位点也在整体去甲基化的过程 中保留了甲基化修饰。

生殖细胞发育过程中的DNA甲基化重编程过程中，大部分区域的甲基化修饰被抹去并重新建立。两轮重编程过程也存在着许多差异。首先，PGC发育过程相比早期胚胎发育过程的DNA去甲基化发生的更为彻底[24]。此外，两轮 DNA甲基化重编程过程的差异主要体现在对印迹调控区的甲基化控制方面，gICRs 的等位基因特异甲基化的状态在 PGC发育过程随着去甲基化过程被消除，在随后的重新甲基化过程中建立，但在早期胚胎发育的去甲基化过程中，gICRs甲基化的状态得到维持[25]DNA 甲基化重编程对于个体发育的意义有：①从遗传持续性的角度，在早期胚胎发育和原始生殖细胞发育过程中发 生的两轮大规模 DNA甲基化重编程过程，其目的是为了消除亲代在生存过程中产生的异常甲基化修饰，从而避免这些异常对于子代的影响[26]；②从细胞分化能力的角度，DNA甲基化对于细胞命运 决定具有重要意义，是一种限制细胞发育潜能的表 观遗传屏障．在生命循环的关键时期，如早期胚胎发育和原始生殖细胞发育时期，消除这种 DNA甲基化的屏障，有助于重新建立发育的潜能[27]；③从胚胎发育特点的角度，哺乳动物发育过程中两轮 DNA 去甲基化有助于基因组印迹的形成，基因组印迹是有胎盘的哺乳动物所特有的，有助于调控胚 胎在母亲子宫内的体积．我们推测两轮的全基因组 去甲基化是哺乳动物进化中的重要一步。

2.2 DNA甲基化在衰老过程中的变化

衰老的DNA甲基化模式为总体DNA甲基化水平降低，但某些特定区域DNA为高甲基化状态[28]。人类DNA甲基化的表观遗传谱随年龄增长不断变化，在不同生活习惯和/或环境得双胞胎中更是明显[29]。这表明老化相关的DNA甲基化改变部分是由环境因素引起的。

年龄相关的低DNA甲基化主要发生在异染色质区域[30]。相反，超甲基化通常发生在非甲基化的CGIs 。随着年龄的增长，一些基因超甲基化也在癌症细胞和其他年龄相关疾病中出现[31，32]。

生育力的下降与母亲年龄增加有关，但生育力下降的具体相关机制仍不清楚。基因组印记在胚胎生长发育和胎盘功能中起着重要作用。而在卵母细胞和受精后早期的胚胎发育过程中会出现基因组印迹的缺陷。如果DNA甲基化缺陷发生在卵母细胞发育过程中，这些缺陷则会在后代中反应出来。Yue等[33]研究了年轻小鼠(6～8周)和老年小鼠(35～40周)的卵母细胞和植入前胚胎的DNA甲基化。结果发现，随着母体年龄的增加，卵母细胞和植入前胚胎的DNA甲基化水平显著降低；此外，老年雌性小鼠的卵裂率、囊胚率以及妊娠率较年轻的雌性小鼠低。与母体衰老相关的生育力下降可能由卵子发生过程中的DNA甲基化缺陷和胚胎着床前发育的缺陷所致。然而，表观遗传评价结果表明，印迹基因H19和SNRPN在受精后3.5天的卵裂球中正常表达，此外，该基因还显示在受精后10.5天的胚胎及其相应胎盘中表达单等位基因。在印迹基因SNRPN、KCNQ1OT1、U2AF1-RS1、PEG1、IGF2R和H19的DMRS(差异甲基化区)的甲基化，以及胚胎和胎盘的全基因组DNA甲基化水平在高龄女性中没有改变。数据表明，能够发育到中期妊娠的胚胎能获得和维持正常的DNA甲基化模式。总而言之，母体老化对卵子发育和受精卵植入前发育过程中的全基因甲基化有不利影响。相比之下，尽管在高龄女性中期妊娠期的不良结局增加，但在相同时期，甲基化印记在活胎中正常维持。

综上所述，DNA甲基化与衰老有关。DNA甲基化的生物学特征主要有Dnmts、CpG岛及DNA去甲基化。人及其他哺乳动物的早期胚胎 DNA 甲基化动态为配子高甲基化、胚胎低甲基化。生殖细胞发育过程中伴随全基因组去甲基化及重新建立DNA甲基化图谱。随母体年龄增加，DNA甲基化水平降低，导致生育力下降。随着DNA甲基化检测技术的发展，特别是全基因组区域内DNA甲基化的可量化分析，与衰老相关的甲基化标记不仅在基础医学研究中，在临床研究中也将发挥重要作用，如可用来监测健康状况并预测寿命，找到有效的药物改善衰老机体的功能，靶向治疗相关肿瘤，提高高龄女性的生育能力等。