CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术治疗神经肌肉单基因病的研究现状

蔡奥捷 孔祥东

郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心（郑州450052）

神经肌肉单基因病是临床上常见的严重疾病之一，病情严重且缺乏有效的治疗手段。目前，在人类已有超过884 种神经肌肉病被证实，涉及到492 个不同的基因（www.musclegenetable.fr），且仍在不断增加中。基因编辑技术，特别是CRISPR/Cas9（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9）的出现［1］能够直接在基因水平上纠正突变基因，为彻底治疗神经肌肉遗传病提供了可能。但是，目前该技术依旧面临着许多的挑战和问题。本综述介绍了以CRISPR/Cas9 为主的基因编辑技术在神经肌肉单基因病治疗的潜在应用进展（本综述所涉及到的文献没有超出伦理规范）。

经典的CRISPR/Cas9 编辑技术原理是Cas9 在sgRNA的引导下，结合PAM（protospacer-adjacent motif）序列旁边的靶基因位点并产生一个双链断裂（double-strand breaks，DSBs），细胞基因组可以通过非同源末端连接（nonhomologous end-joining，NHEJ）或同源重组（homology directed repair，HDR）的方式来修复DSBs［2］。其中，NHEJ 导致不精确的插入/缺失突变，HDR 通过同源重组将外源核苷酸序列引入基因组来产生精确修饰。利用CRISPR/Cas9 技术，能够通过介导基因敲除、基因敲入、相关基因表达激活或抑制等来纠正疾病缺陷基因，达到治疗疾病的目的。该方法用于单基因病的突变修复已在多种组织细胞和模式动物中得到验证，显示出良好的效果。

1 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除

以CRISPR/Cas9 为主的基因编辑技术通过切除突变基因或其上下游部分基因，来纠正或改善疾病的病理特征和临床表现，被广泛应用于包括杜氏肌营养不良（duchenne muscular dystrophy，DMD）、脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）及强直性肌营养不良症（myotonic dystrophy，DM）1 型等神经肌肉遗传病的基因治疗。主要适用范围为编码基因阅读框架的缺失以及核苷酸重复等。

1.1 阅读框架缺失 DMD 是由DMD基因（OMIM300377）突变导致的X 连锁隐性遗传病，其发病率约为1/5 000 活产男婴。DMD基因编码抗肌萎缩（dystrophin，Dys）蛋白，其为细胞骨架蛋白，能够维持肌肉细胞的完整性，如缺失会导致出现肌萎缩、肌无力和肌坏死等不良肌肉表现。该病的主要突变方式为外显子的重复或丢失从而造成的编码基因阅读框架异常。对于DMD基因突变患者，可以通过跳跃突变所在的外显子或其相邻部位的外显子来创建DMD基因组内部的缺失来恢复阅读框架，从而改善DMD患者抗肌萎缩蛋白功能。该方法最早是由OUSTEROUT等［3］利用ZFN 在DMD 患者成肌细胞中去除DMD基因第51外显子来实现。MAGGIO 等［4］通过设计一体化的腺病毒介导的CRISPR/Cas9 对DMD基因第45-52 外显子缺失（DMD.Δ45-52）和第48-50 外显子缺失（DMD.Δ48-50）患者来源的成肌细胞DMD基因第51 外显子进行跳跃，成功修饰并表达Dys 蛋白。此外，LI 等［5］也通过跳跃DMD基因第45 号外显子来恢复DMD.Δ44 患者的部分Dys 蛋白功能。

1.2 核苷酸重复 DM1 是一种常染色体显性遗传病，发病率大约为1/8 000，主要表现为肌萎缩、肌无力和肌强直。该病主要致病原因为编码强直性肌营养不良蛋白激酶（myotonic dystrophy protein kinase，DMPK）基因（OMIM 605377）非编码区域3′端（CTG）n 的重复序列异常扩增。当该三联核苷酸重复次数从正常的5～37 增加到超过50时，就会造成RNA 结合蛋白的隔离以及DMPK 基因的广泛异常剪接和（或）沉默，产生DM1 的临床表现［6］。有研究［7］利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，成功敲除DMPK 基因3′端（CTG）n 重复序列来修复DM1 患者来源iPSC 诱导的成肌细胞，并通过Southern 印迹和单分子实时（single-molecule real-time，SMRT）测序证实了CTG 重复扩增序列的高效切除。该方法介导的核苷酸重复序列切除也适用于Friedreich型共济失调或脊髓小脑共济失调8型等。

2 CRISPR/Cas9 介导的基因敲入

在CRISPR/Cas9 介导的外显子跳跃治疗方法中，主要原理是通过NHEJ 引起的模糊缺失/修复来阻止外显子剪接进而恢复蛋白表达。然而，此方法不适用于突变位于外显子内编码蛋白质基本域的情况，这时就需要HDR 介导的精确修复。有研究［8］通过HDR 成功修复mdx 小鼠模型dmd 基因的第23 外显子的无义突变。但HDR 介导的修复效率通常低于NHEJ，并且HDR 需要在细胞周期的S 期和G2 期才能发挥作用，因为此时的姐妹染色单体才可以作为修复模版补充目的基因。随着基因编辑技术的不断发展，一系列提高HDR 介导的修复效率的方法被发现，如通过降低NHEJ 活性来减少与HDR 竞争的方法［9］，此类方法在DMD 完全修复治疗的研究中可能得到应用。

该策略同样适用于SMA 的基因治疗。SMA 是常染色体隐性遗传的神经肌肉病，在新生儿的发病率大约为1/6 000～1/10 000，人群携带者频率为1/40～1/50。运动神经元生存基因（survival motor neuron，SMN1）（OMIM600354）基因的突变是造成该病发生的主要原因，但其临床表现受到SMN1的同源基因SMN2（OMIM601627）的调节。SMN2与SMN1的主要不同在于第7 外显子中c.840 位点的C＞T的碱基差异。该异常能导致编码的蛋白缺少第7 外显子编码的核心区域，产生不稳定的“截短蛋白”（SMNΔ7）和低产率的全长蛋白质（仅约10%～15%）。在SMN1中有缺失/突变的SMA 患者中，SMN2能起剂量补偿作用，其拷贝数会影响疾病的严重程度（SMN2的拷贝数越多，患者表现症状越轻）。有研究［10］利用CRISPR-cpf1 和单链寡核苷酸介导HDR 将来自SMA 患者尿液细胞诱导的iPSC 中SMN2基因修饰为SMN1样基因，成功改善了神经元，可能为SMA 的治疗提供一种光明的前景。

3 相关基因表达激活或抑制

对于一些疾病来说，通过激活目的蛋白功能相近或者抑制目的蛋白功能相反的蛋白基因的表达也可以改善疾病的临床表现。Utrophin（UTRN）作为Dys 蛋白结构相似的旁系同源物，上调其转录水平能够代偿性的补偿Dys蛋白缺失的影响。WOJTAL 等［11］利用dCas9-VP160 的双sgRNA 靶向两个UTRN 启动子来上调utrophin 的表达量，结果显示能够将DMD 患者成肌细胞中的utrophin 蛋白表达提高1.7～6.9倍。在表达抑制上，有研究［12］针对肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）这种能导致肌肉萎缩的蛋白，利用AAV8介导的SaCas9 在组织特异性双肌肉肌酸激酶（dMCK）启动子的帮助下体内靶向肌肉组织，抑制MSTN 表达，在野生型小鼠中能够减弱肌肉损失。此外，有研究［13］证明dCas9与转录阻遏蛋白Kruppel-associated box 结构域（KRAB）的融合能够通过招募异染色质来有效抑制内源基因的转录，能够沉默大约80%的基因，可以被作为DMD 等基因治疗研究的一个突破口。

4 碱基替换

对于一些点突变患者，单碱基编辑的策略显得更为实用。有研究［14］将APOBEC1 连接在dCas9 的N 端，能够诱导C→T 突变，并显示出比HDR 更高的效率。此外，GAUDELLI 等［15］通过将腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editors，ABEs）与催化功能受损的CRISPR/Cas9 结合，成功诱导碱基替换而不会发生DNA 双链切割。该技术不仅能全面的对点突变进行直接修复，而且能够通过破坏提前终止密码子或剪接受体来诱导外显子跳跃。

5 基因编辑技术临床应用面临的问题

然而，CRISPR/Cas9 介导的基因治疗依然面临着许多重要的问题，其中最重要的是脱靶效应以及安全性问题。

5.1 脱靶效应 脱靶效应是CRISPR/Cas9 介导的基因治疗研究中不可忽视的重要问题。脱靶可能通过引起未知位置的不确定的插入和缺失来导致基因组的不稳定，提高潜在的疾病罹患风险。目前人们可以通过全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）来监测是否存在脱靶效应，但该方法需要较高的测序深度和灵敏度，花费较高。目前有许多种方法被发现用来能够提高CRISPR/Cas9 系统的特异性或者减少其脱靶效应，如截短的sgRNA、fCas9 系统策略（FokⅠ-dCas9）［16］、Cas9-sgRNA 的剂量滴定［17］以及增 强 版［18］或 高 保 真［19］的Cas9 等。新 发 现 的CRISPRCas13a 似乎具有更强的特异性，研究人员利用RNA 测序证实在人类细胞系中，Cas13a 只会靶向由导向RNA 指定的RNA，而让细胞内其他的RNA 序列保持完整［20］。

5.2 安全性问题 CRISPR/Cas9 是一种源自于微生物的基因编辑系统，目前使用最广泛的Cas9 蛋白是来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的SaCas9 和来自化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9。在CRISPR/Cas9 介导的基因治疗过程中，当AAV 或者其他载体携带Cas9 蛋白进入人体后，这些载体介导Cas9 蛋白的持续表达，若患者体内预先存在针对Cas9 抗原的特异性记忆T 细胞，则记忆T 细胞会迅速活化为细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）对胞内有Cas9 蛋白表达的细胞进行直接杀伤，从而导致基因治疗失败，甚至有可能引发严重的免疫反应，导致器官功能障碍。研究［21］发现，在70%的健康人体内发现了Cas9 蛋白同源物抗体，近半数人具有Cas9 蛋白同源物的抗原特异性T 细胞，而且这些特异性T 细胞是原本就存在，而非在检测过程中由于首次暴露于抗原产生的。这意味着，在大部分人体内原本就存在针对Cas9 蛋白的体液免疫和细胞免疫，也提示在人体中已经存在的适应性免疫反应可能难以保证CRISPR/Cas9 的安全性和有效性，其治疗的安全性应该慎重评估。

此外，病毒载体本身可能导致的免疫和毒性反应也是CRISPR/Cas9 介导的基因治疗安全性评估的重要方面。由于人体内没有预先存在针对AAV 的抗体，且该病毒不整合入基因组，因此AAV 是目前CRISPR/Cas9 基因治疗研究最有前景的载体。2018年一个研究［22］发现在恒河猴和仔猪身上高剂量使用载体AAV9 进行SMA 基因治疗时，会产生严重的肝脏和神经元毒性。研究结果表明，肝脏和感觉神经元毒性可能是高剂量静脉内递送AAV 载体的普遍性质，与衣壳血清型或转入基因无关。因此，探究AVV 载体免疫毒性发生的原因和机制，提出解决策略并评价病毒剂量的安全范围，对今后的临床研究意义重大。

6 小结

虽然以CRISPR/Cas9 为主的基因编辑策略依然面临着许多亟待解决的问题，但不可否认的是其飞速发展为神经肌肉单基因遗传病在内的许多遗传病的彻底治愈带来了光明的前景。受益于基因编辑技术的发展，目前关于人体体细胞的基因编辑实验已经得到测试。近日，Editas Medicine 公司开展的使用CRISPR 基因编辑手段治疗Leber 先天性黑朦10 型患者（LCA10）临床实验已经获得FDA 的批准，该方法通过眼部局部注射并利用感光细胞特异性启动子GRK1，大大降低了安全性问题，是CRISPR 基因治疗领域的重要里程碑。然而，目前尚无有效的手段能够彻底解决包括脱靶效应和免疫问题带来的影响，对于胚胎或配子的可遗传基因组编辑带来的风险仍然难以评估。种系编辑不仅会对个体产生意想不到的有害影响，也会对个体的后代产生难以评估的风险。基因治疗的发展应遵循严格的技术监管、合理的伦理支撑以及广泛的社会监督，应该加强国际间的交流合作，尽快制定关于基因编辑技术的国际化技术标准和适合各国实际国情的伦理规范。