一次药敏试验及其应用

徐玉斌 （甘肃省华池县动物疫病预防控制中心 745600）

随着新型致病菌的不断出现，抗菌药对细菌性传染病的控制起到了非常重要的作用，但由于养殖过程中不科学、盲目的滥用抗菌药，很多致病性细菌产生了耐药性，使得抗菌药对细菌性疾病的控制效果越来越差，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。并且各种致病菌对不同的抗菌药物的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也有差异。因此，通过药敏试验，掌握致病菌对药物的敏感性，指导临床用药，提高疗效。

1 流行病学调查

某养殖户，养羊95只，发病羊30只，病死2只。临床症状有体温升高41℃，食欲废绝，咳嗽，消瘦，流浓鼻。剖解肺间质增厚，有肉样变化，伴随出血，肝脏和胆囊肿大。曾经用青霉素、板蓝根注射液、磺胺间甲氧嘧啶钠治疗。治疗无效后送检病死羊肺组织、肝组织进行药敏测定。

2 试验步骤

2.1 细菌培养

2.1.1 材料用具 培养基(可购买成品)、培养皿、电子天平、锥形瓶、电磁炉、石棉网、玻璃棒、pH试纸、氯化钠、氢氧化钠、瓶口塞、酒精灯、接种环、酒精棉球、记号笔、吸水纸、恒温箱、高压锅。

2.1.2 培养基的制备 按照各类微生物生长的需要将多种营养物质进行人工合成：（1）称取蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g溶解于1000ml的超纯水中。（2）用试剂氯化氢(酸)和氢氧化钠(碱)校正酸碱度，使其达到pH值7.2～7.4。加入琼脂15g，在电磁炉上垫石棉网，用玻璃棒搅拌加热直至溶解。（3）瓶口塞棉塞，包装后置高压锅内，同时也将接种平皿用报纸包好置于其内，121℃高压灭菌30min。（4）经高压灭菌后趁热取出，温度降到56度左右，在生物安全柜里将培养基倾入灭菌的培养皿，每一空皿倾入培养基20ml，放入4℃冰箱中备用。

2.1.3 病料处理 在超净工作台上取出采集的肺组织、肝组织，用灭菌手术刀剪剪去手指大小的病变边缘组织，然后用吸水纸吸干组织水分，在酒精灯火焰上灭菌固定，最后剪开组织进行接种培养。

2.1.4 细菌接种 （1）用洗手液将双手洗净，擦干，再用75%酒精棉球檫试双手。当手上酒精挥发完毕后，点燃酒精灯。（2）对接种环火焰灼烧灭菌，冷却后分别蘸取接种物，开始在培养皿划线。左 手 斜 持 平皿(45°角)，用拇指打开皿盖，使其与皿底间分开成2～3cm宽的缝隙，靠近火焰周围，右手握持接种环伸入平皿内，在平皿上端1/6范围来回划线，密集涂布。然后用腕力在原划线处作连续平行划线，划线时使接种环与平板成30°～40°角，划线间距适当，不能重叠。（3）接种完毕后，将接种环火焰灭菌后放回，用记号笔在皿底玻璃上注明组织名称，接种时间等，将培养皿倒置，送进温箱。（4）经37℃ 18～24h孵育后取出，观察琼脂平板表面细菌生长情况。

2.2 药敏试验

将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，可以使抑菌范围外的菌株生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度。

2.2.1 材料准备 药敏试纸(购买)、接种环、酒精灯、镊子、恒温箱、毫米尺。

2.2.2 操作步骤 （1）在“超净台”中，用经火焰灭菌的接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（2）将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，选取庆大霉素、青霉素、链霉素、氨苄西林、林可霉素、复方新诺明、卡那霉素、头孢曲松、呋喃唑酮、环丙沙星药敏片贴到平皿培养基表面。用镊子轻按几下药敏片，使药敏片与培养基紧密相贴。先在平皿中央贴一片，然后外周等距离贴(外周一般可贴7片)。（3）将平皿培养基置于37℃温箱中培养24h后，观察效果。

2.2.3 结果观察与判断 过夜培养后形成一个抑菌圈，用毫米尺测量抑菌圈直径，庆大霉素11mm、青霉素4mm、链霉素4mm、氨苄西林6mm、林可霉素1mm、复方新诺明12mm、卡那霉素12mm、头孢曲松9mm、呋喃唑酮5mm、环丙沙星12mm。抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，在15mm以上为高敏，10～15mm为中敏，小于10mm为低敏，无抑菌圈为不敏。

3 药敏试验的应用

药物敏感实验后，选择高敏药物进行治疗，推荐药物有复方新诺明、卡那霉素、环丙沙星、庆大霉素。选用复方新诺明进行临床治疗，0.08g/kg给药，首次加倍，2次/d，连用3d。经过治疗病情得到控制，3d治愈力87%，根据综合治愈力来看复方新诺明疗效是明显的，是临床的理想药物。同时在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以用药时，要考虑给药方法，这样才会达到好的治疗效果。