粪便多靶点DNA和miR-135b表达联合检测诊断结直肠癌的价值

张江国，汪之沫

(1 深圳市蛇口人民医院，广东深圳518052；2 深圳市南山区人民医院)

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于胃癌、食管癌。近年来随着我国居民生活方式改变、人口老龄化加剧等，其发病率呈逐年上升趋势[1，2]。由于其早期症状不明显，多数患者就诊时已属中晚期，预后往往较差。目前，临床早期筛查结直肠癌的常用手段有粪便隐血试验、粪便免疫化学试验、结肠镜检查等，但粪便隐血试验和免疫化学试验的敏感性较低，而结肠镜检查虽然是筛查结直肠癌的金标准，但检查费用较高，难以推广普及。因此，探索一种敏感性和特异性均较高的早期筛查方法具有重要的临床意义。粪便DNA检测是一种无创筛查恶性肿瘤的新方法，通常检测异常骨形态发生蛋白3(BMP3)、N-myc下游调节基因4(NDRG4)基因甲基化以及Kras突变。国内外已有应用粪便DNA检测筛查恶性肿瘤的报道，如通过粪便DNA中异常BMP3基因甲基化筛查肺鳞癌、异常NDRG4基因甲基化筛查胃癌、Kras突变筛查胰腺癌或胃癌等[3]。微小RNA(miRNA)是在真核生物中发现的一类具有调控功能的内源性非编码RNA，可参与机体发育、细胞增殖或凋亡等。近年研究发现，在恶性肿瘤组织中有多种miRNA异常表达，并参与恶性肿瘤的发生、发展。miR-135b是miRNA家族中的一员，其在前列腺癌组织中异常表达，并可用于前列腺癌的早期筛查[4]。已有研究证实，粪便多靶点DNA、miR-135b表达单独检测对结直肠癌早期筛查的敏感性、特异性和准确性有限[1]，而联合检测有可能是最有前景的非侵入性筛查手段。但目前相关报道较少。本研究探讨粪便多靶点DNA和miR-135b表达联合检测诊断结直肠癌的价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年4月～2017年11月深圳市蛇口人民医院收治的初诊结直肠癌患者35例(观察组)。所有患者诊断符合《中国结直肠癌诊疗规范(2015版)》[2]，入院前未行任何抗肿瘤治疗，入院后接受手术治疗，术后组织病理检查证实为结直肠腺癌。排除合并心、肝、肾等重要脏器严重疾病者，病理学类型为非腺癌者，入组前接受过任何抗肿瘤治疗者。其中，男19例、女16例，年龄47～84岁、平均64岁。同期选择因胃炎、消化性溃疡等住院的非肿瘤患者39例(对照组)，男24例、女15例，年龄24～84岁、平均48岁。两组性别构成比较P>0.05，年龄比较P<0.05。本研究经深圳市蛇口人民医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 粪便多靶点DNA和miR-135b表达检测

1.2.1 粪便多靶点DNA检测 取两组新鲜粪便标本，采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit提取粪便DNA，经NanoDrop-1000超微量分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，可用于后续实验。以提取的粪便DNA为模板，按人类Kras基因7种突变检测试剂盒说明进行实时荧光定量PCR扩增。BMP3、NDRG4基因甲基化引物序列及其探针序列由武汉安思威科技有限公司设计合成。引物序列：BMP3基因甲基化上游引物5′-GTTTAATTTTCGGTTTCGTCGTC-3′，下游引物5′-CGCTACGAAACACTCCGAAA-3′，检测探针5′-GACGCGGAGCGGTTTTTTGCG-3′，TaqMan荧光探针FAM-TCTT-BHQ1-AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACTCCGCGTCCGT-C6-NH2；NDRG4基因甲基化上游引物5′-CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG-3′，下游引物5′-GTAACTTCCGCCTTCTACGC-3′，检测探针5′-GAC-GCGGAGGTTCGTTTATCG-3′，TaqMan荧光探针FAM-TCTT-BHQ1-AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACTCCGCGT-CCGT-C6-NH2；β-actin上游引物5′-TTTGTTTTTTTGATTAGGTGTTTAAGA-3′，下游引物5′-CACCAACCTCATAACCTTATC-3′，检测探针5′-CGCCGAGGATAGTGTTGTGG-3′，TaqMan荧光探针VIC-TCTT-BHQ1-AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACCTCGGCGCG-C6-NH2。PCR反应体系共20 μL：1×Loading Buffer 15 μL，500 nmol/L上下游引物各0.5 μL，500 nmol/L检测探针1 μL，250 nmol/L荧光探针1 μL，250 μmol/L dNTP 2 μL，Taq酶1 U，FEN1酶150 U，模板DNA 1×103copies。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s、67 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s预扩增10个循环，95 ℃ 20 s、53 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s扩增40个循环。以β-actin为内参，利用荧光标记的甲基化基因与内参基因得到两条实时荧光扩增曲线，设定荧光阈值，得到ΔCT值(CTBMP3-CTβ-actin或CTNDRG4-CTβ-actin)，甲基化指数=2-ΔCT×100%。以BMP3、NDRG4基因甲基化指数均>25%为粪便多靶点DNA阳性[5]。

1.2.2 粪便miR-135b表达检测 取两组新鲜粪便标本，采用TRIzol法提取总RNA，经NanoDrop-1000超微量分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，可用于后续实验。按TaqMan miRNA反转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按SYBR Green Realtime PCR Master Mix说明进行PCR扩增。引物序列由上海英俊生物技术有限公司设计合成。miR-135b上游引物5′-CCTGGCTTTTCATTCCTATGTGA-3′，下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCCACATATACTAAA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应体系共20 μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物各2 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL；反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40个循环。将人工合成的miR-135b配制成浓度分别为0.01、0.1、0、10、100、1 000、10 000、100 000 ng/L的标准反应样本，经逆转录反应和PCR扩增，得到不同浓度样本的CT值，以浓度对数值为X轴、CT值为Y轴作散点图，线性拟合后制作标准曲线，得到线性方程Y=2.719logX+10.518 4(R2=0.961 8)。将粪便miR-135b的CT值带入标准曲线，求出样本浓度，并量化至1 ng粪便RNA的miRNA copies[4]。

2 结果

2.1 两组粪便多靶点DNA、miR-135b表达比较 观察组与对照组粪便多靶点DNA阳性例数分别为23(65.71%)、4例(10.26%)，粪便miR-135b表达分别为(72.8±18.2)、(34.5±20.0)copies/ng，两组比较P均<0.01。

2.2 粪便多靶点DNA、miR-135b表达单独和联合检测诊断结直肠癌的价值分析 ROC曲线分析显示，粪便多靶点DNA阳性单独检测诊断结直肠癌的曲线下面积为0.78(95%CI：0.68～0.88)，此时其诊断结直肠癌的敏感性为70%、特异性为90%；粪便miR-135b表达单独检测诊断结直肠癌的曲线下面积为0.86(95%CI：0.80～0.93)，其cut off值为69.9 copies/ng，此时其诊断结直肠癌的敏感性为91%、特异性为81%；粪便多靶点DNA阳性与miR-135b表达联合检测诊断结直肠癌的曲线下面积为0.93(95%CI：0.89～0.98)，其诊断结直肠癌的敏感性为97%、特异性为74%。粪便多靶点DNA阳性与miR-135b表达联合检测诊断结直肠癌的ROC曲线下面积明显高于粪便多靶点DNA阳性单独检测(P<0.05)，与粪便miR-135b表达单独检测的ROC曲线下面积比较P>0.05。

3 讨论

近年来，随着居民生活方式改变、人口老龄化加剧等，我国结直肠癌的发病率呈逐年上升趋势[1，2]。由于其早期症状不明显，多数患者就诊时已属中晚期，预后往往较差。早发现、早诊断、早治疗是提高结直肠癌患者预后的关键。目前，临床早期筛查结直肠癌的常用手段有粪便隐血试验、粪便免疫化学试验、结肠镜检查等。其中，粪便隐血试验早期筛查结直肠癌的敏感性和特异性均较低；粪便免疫化学试验虽然筛查结直肠癌的敏感性较高，但其特异性较差；结肠镜检查是诊断结直肠癌的金标准，但其检查费用较高，难以大规模推广。因此，探寻一种价格低廉且敏感性和特异性均较高的结直肠癌筛查方法具有重要意义[4]。

粪便DNA检测是一种无创筛查恶性肿瘤的新方法，通常检测异常BMP3、NDRG4基因甲基化以及Kras突变。国内外已有应用粪便DNA检测筛查恶性肿瘤的报道，如通过粪便DNA中异常BMP3基因甲基化筛查肺鳞癌、异常NDRG4基因甲基化筛查胃癌、Kras突变筛查胰腺癌或胃癌等。BMP3、NDRG4基因过度甲基化会导致基因转录沉默，从而抑制BMP3、NDRG4蛋白合成，进而促进结直肠癌的发生、发展。Kras是ras基因家族成员，具有调控细胞生长作用，如Kras突变时，该基因会永久活化，其编码的ras蛋白异常，可使结直肠细胞增殖失控继而癌变[6，7]。有研究报道，应用粪便BMP3、NDRG4基因甲基化和Kras突变等基因检测筛查结直肠癌的敏感性要明显高于粪便免疫化学试验[8，9]。miRNA是在真核生物中发现的一类具有调控功能的内源性非编码RNA。近年研究发现，在恶性肿瘤组织中存在多种miRNA异常表达，并参与恶性肿瘤的发生、发展。miR-135b是miRNA家族中的一员，其在胃癌、骨肉瘤等实体肿瘤中表达明显升高。miR-135b能够靶向抑制抑癌基因APC表达，故其表达上调可促进肿瘤的发生、发展[10,11]。Wu等[4]研究发现，粪便miR-135b表达筛查结直肠癌的敏感性为78%、特异性为68%，提示粪便miR-135b表达检测可作为筛查结直肠癌的非侵入性手段之一。粪便BMP3、NDRG4基因甲基化异常和Kras突变能够在转录水平上反映肿瘤细胞存在，而粪便miR-135b表达异常能够在转录后基因调控水平上反映肿瘤细胞存在。但已有研究证实，粪便多靶点DNA阳性、miR-135b表达单独检测对结直肠癌早期筛查的敏感性、特异性和准确性有限，而联合检测有可能是最有前景的非侵入性筛查手段。本研究结果发现，观察组粪便多靶点DNA阳性例数明显高于对照组，粪便miR-135b表达亦明显高于对照组，表明结直肠癌患者存在粪便多靶点DNA甲基化和miR-135b表达异常，有可能成为结直肠癌筛查的指标。

由于表观遗传修饰是对环境压力的一种动态反应，BMP3、NDRG4基因超甲基化和Kras突变可能存在肿瘤细胞内或细胞间的表观遗传异质性[12～14]，故单分子表观遗传学检测诊断结直肠癌的敏感性和特异性较低。结直肠癌组织miR-135b表达可能亦存在异质性，因此单独检测粪便miR-135b表达诊断结直肠癌的效能可能较低[15，16]。本研究结果发现，粪便多靶点DNA阳性单独检测诊断结直肠癌的ROC曲线下面积为0.78，其诊断敏感性为70%、特异性为90%，与Cooper等[14]研究结果相似；粪便miR-135b表达单独检测诊断结直肠癌的ROC曲线下面积为0.86，其cut off值为69.9 copies/ng，此时其诊断敏感性为91%、特异性为81%，略高于Wu等[4]的研究结果，可能是由于Wu等[4]的研究队列中包括IBD患者，从而影响了粪便miR-135b表达诊断结直肠癌的敏感性和特异性。进一步研究发现，粪便多靶点DNA阳性与miR-135b表达联合检测诊断结直肠癌的ROC曲线下面积明显高于粪便多靶点DNA阳性单独检测，提示粪便多靶点DNA阳性与miR-135b表达联合检测较粪便多靶点DNA阳性单独检测具有更好的诊断效能；粪便多靶点DNA阳性与miR-135b表达联合检测诊断结直肠癌的ROC曲线下面积虽高于粪便miR-135b表达单独检测，但差异无统计学意义，可能是粪便多靶点DNA阳性与miR-135b表达联合检测的诊断效能与粪便miR-135b表达单独检测的诊断效能确实没有统计学差异，也可能是由于病例的局限性，联合检测的诊断效能未能得到充分发挥，尚需进一步临床研究验证。

综上所述，粪便多靶点DNA和miR-135b表达联合检测对结直肠癌的诊断效能较高，有可能作为结直肠癌早期筛查的方法在临床中推广应用。