Hedgehog信号通路及其与非小细胞肺癌关系的研究进展

陈盈盈，展翼翼，刘春玲

(新疆医科大学第三临床医学院，乌鲁木齐830011)

据统计，肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类的生命安全[1]。肺癌大致分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌两类，其中NSCLC约占85%。虽然近年晚期表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的NSCLC在使用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗后获得了显著疗效，但疾病复发转移、耐药突变仍是不可避免的问题。自Hedgehog(Hh)信号通路被发现以来，一系列研究表明，其不但调控胚胎发育和干细胞分化[2，3]，而且在维持肿瘤起始/干细胞特性方面有重要作用，与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[2]。随着肺癌发病机制分子学研究的进展，Hh信号通路在NSCLC发生发展中的重要作用已被证实[3]。本文分析Hh信号通路的结构与传导，并对其在MSCLC发生发展、治疗、耐药中的作用作一综述。

1 Hh信号通路的结构与传导

1.1 结构 在脊椎动物中，Hh通路结构组成包括作为配体的Hh分泌蛋白，分布于靶细胞膜上的受体Patched(Ptch)蛋白、Smoothened(Smo)蛋白，转录因子(Gli)蛋白家族，主要校正器(Sufu)蛋白及下游的驱动蛋白(Kif7)、蛋白激酶A(PKA)和环磷腺苷(cAMP)等[4]。此外，在Corbit等[5]研究证实，Hh信号通路与初级纤毛(PC)息息相关，PC不仅为通路组件的分布提供了至关重要的特殊细胞腔隙，而且还能调节通路的信号浓度和作用细胞的应答，从多方面保证了Hh通路发挥功能。

1.1.1 Hh蛋白 相对于染色体只有四对的果蝇，在生命架构更高级的脊椎动物中，由于基因组的重复，Hh基因扩增，Hh蛋白有三个亚组同源物，分别为Sonic Hedgehog(Shh)、Desert Hedgehog(Dhh)和Indian Hedgehog(Ihh)[6]。其中，Shh是哺乳动物中表达最广泛的Hh蛋白，贯穿胚胎发育到器官形成过程；Ihh特异性地在原始内胚层、骨、消化道中表达；Dhh表达主要限于性腺，包括睾丸的支持细胞和卵巢的颗粒细胞。但在所有哺乳动物中，Hh蛋白具有相似的生理效应[7]。

1.1.2 Ptch蛋白 Ptch蛋白是由肿瘤抑制基因Patched编码，12个单一肽链构成的跨膜蛋白，具有在细胞膜上接受Hh信号蛋白和抑制Smo蛋白的功能，对Hh信号通路起负性调控作用[8]。脊椎动物有两个Ptch同系物：Ptch1和Ptch2。既往研究显示，Ptch蛋白的功能主要体现在Ptchl蛋白上，其中Ptch1类固醇依赖性地与上游Shh蛋白结合[9]，Ptch2蛋白是Ptchl蛋白的旁系同源，可以弥补Ptchl蛋白的部分功能。

1.1.3 Smo蛋白 Smo蛋白是由1 024个氨基酸组成的七次跨膜蛋白，在结构上类似G蛋白偶联受体，但在细胞外富含维持其功能的半胱氨酸结构域[10]。研究显示，Smo蛋白是Hh信号传导途径中的辅助受体，代表受体复合物的信号传导组分，是Hh信号的转换器，同时因其在缺失Ptch1的情况下仍能促进Hh信号通路下游成分的激活，也被认为是Hh信号通路中的正性调节因子[11]。

1.1.4 Gli转录因子 Gli蛋白最初是从胶质母细胞瘤中分离出来，定位于细胞核和细胞质，是通路下游的多功能转录因子。在脊椎动物中，Gli蛋白家族有三个成员：Gli1、Gli2、Gli3[12]。三者均有5个保守的锌指DNA结合结构域。其中Gli2和Gli3因在氨基末端有阻遏结构域，在羧基末端有活化结构域的特殊结构，均可充当通路的抑制剂和激活剂；而Gli1因缺乏氨基末端阻遏物结构域，在通路中仅有激活剂的功能。在通路信号传导中，三者协作，通过直接结合启动子来调节靶基因的表达[13]。

1.1.5 Sufu蛋白、Kif7蛋白、PKA、cAMP及下游靶基因 Sufu蛋白定位于细胞核，直接与Gli蛋白结合，在Gli的稳定和加工中起关键作用，保证了Hh信号准确传导，是关键负调节因子。驱动蛋白Kif7是Hh信号传导的一个组成部分，可以作为正调节因子和负调节因子，但具体作用方式尚未完全清楚，现在发现的一种可能机制是蛋白磷酸酶2A对Kif7磷酸化的翻译后控制[14]。cAMP依赖性PKA也是Hh通路的重要负调节因子，位于纤毛的基部并调节Gli蛋白氨基端和羧基端的复合物形成[15]，因此PKA的活性对Hh信号传导同样至关重要。Hh通路的下游，还有大量参与调控信号传导的靶基因，诱导细胞增殖分化及促进肿瘤发生等。

1.2 信号传导 与其他信号通路一样，Hh通路也是通过信号串联传导信息。Hh蛋白是整个通路的启动因子，是Ptch的配体，Smo是信号转导子。通过Patc、Smo与Hh配体的结合及激活后是否依赖Gli蛋白发挥生物学效应，分为经典的Hh/Gli信号通路和非经典的Hh信号通路[16]。经典激活途径：即Hh配体与Ptch结合，解除Ptch1对Smo的抑制，从而导致转录因子Gli入核，这是哺乳动物途径激活的必要步骤。非经典激活途径：可分为不依赖Smo蛋白的Ⅰ型和依赖Smo蛋白不依赖GLi蛋白的Ⅱ型。此外脊椎动物中还存在与Ptch结合的共受体，如生长阻滞特异蛋白1、半胱氨酸双加氧酶等，与Ptch一起形成受体复合物，共同传递通路信号。

2 Hh信号通路与NSCLC的关系

2.1 Hh信号通路在NSCLC发生发展中的作用 Hh信号通路在胚胎肺发育和出生后肺发育过程中起关键作用[17]。在健康成人肺组织中，Hh信号传导维持成人肺部稳定并调节修复[18]。然而，目前尚不清楚Hh信号传导如何一方面促进肺部稳定，另一方面促使肿瘤发生。近年研究证实，在小细胞肺癌中，常有Shh途径表达上调，Gli转录因子激活[19]。有研究则证实Smo可在体外促进人小细胞肺癌的克隆及小鼠体内小细胞肺癌的起始和进展[20]。

目前已有大量研究多环节、多步骤证明Hh通路在NSCLC发生发展中起重要作用。Bai等[21]研究发现Hh通路分子Shh、Dhh、Ihh、Smo及Gli3在NSCLC组织中均广泛表达；Gli3高表达可能参与促进了NSCLC患者发生淋巴结转移。Shi等[22]分离来自人大细胞肺癌细胞系中具有干细胞功能的H460SP细胞后显示，H460SP细胞不仅能增强致瘤性，更重要的是其优先表达Smo，进一步提示了Hh信号在调节大细胞肺癌干细胞中的作用。Bermudez等[23]在2013年通过抑制Shh信号传导，导致NSCLC细胞在Gli1和Gli2介导下增殖降低；并深入研究发现了肺腺癌和肺鳞状细胞癌(鳞癌)细胞都分泌Shh配体，可诱导成纤维细胞增殖、迁移，介导肿瘤组织中血管和成纤维细胞生成，在NSCLC上皮间质化(EMT)中起重要作用。后续研究发现，肺鳞癌组织中Ptch、Smo和Gli2表达上调，且抑制了Gli2表达后，肿瘤细胞增殖明显受阻并伴有广泛的细胞凋亡[24]；Gli1表达则与肺鳞癌的T分期、淋巴结转移和临床分期密切相关，Gli1阳性的肺鳞癌组织微血管密度明显高于阴性者[25]。在肺腺癌组织中Gli1表达在76%左右，可能是由于表观遗传沉默。在超过一半的肿瘤组织中，经典的Hh途径激活剂Smo呈低表达水平，初步推断Gli1可能是致癌途径的下游效应物[26]。同时，在通路的下游，对部分微小RNA(miRNA)的功能分析显示，miR-326能通过直接靶向Smo和Gli2而充当Shh信号传导的负调节剂，引起肺疾病；miR-520b通过激活Hh通路和Gli2、Gli3的稳态化，促进NSCLC细胞的增殖和转移。此外，研究还发现，在NSCLC组织中，Hh信号通路常与其他通路处于会聚或串扰状态，如肺腺癌中，当EMT相关基因过表达和Hh传导途径激活后，腺癌细胞和癌相关成纤维细胞可以通过相互作用，促进腺癌细胞转移；也有研究指出原癌基因蛋白激酶1在肺鳞癌细胞内激活细胞经典Hh途径，诱导肿瘤细胞增殖[27]。

2.2 Hh信号通路在NSCLC治疗中的作用 目前，Hh信号通路作用于NSCLC的确切位点，仍存在疑问。因此，虽然Hh基因已经发现了30余年，却无法比拟晚期表皮生长因子受体(EGFR)、间变性淋巴瘤激酶基因在NSCLC治疗上的进展。环巴胺是首个被发现的可以抑制Smo的植物碱。有研究用环巴胺处理NSCLC细胞，发现其通过作用于线粒体，达到抑制肿瘤细胞增殖并凋亡的目的[28]。尽管后续有研究证明环巴胺类抑制剂只对Hh通路上游基因变化导致的肿瘤有作用，而对于Smo级联反应以下参与Hh信号通路调控分子的异常变化无治疗意义，但通过近期一系列的研究与分析，Hh信号通路仍被评价为有前景的治疗目标[29]。环巴胺可使肺腺癌和肺鳞癌细胞增殖和活力降低，并增强植物化学物质双去甲氧基姜黄素诱导肺腺癌自噬的作用[30]。虽然Smo拮抗剂维莫德吉也可引发明显的自噬，但未在肺腺癌细胞中明显诱导细胞死亡和肿瘤缩小；而在肺鳞癌细胞中，Smo拮抗剂或其他Hh途径激动剂均未影响Gli1的表达，但可通过抑制或激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和丝裂原活化蛋白激酶途径来调节Gli1表达，从而抑制肿瘤细胞增殖。针对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径和Gli1的组合治疗策略，可导致PI3K途径依赖性癌症的有效缓解，效果优于使用单药PI3K拮抗剂的人体试验结果[31]。有研究报道，Hh途径抑制剂治疗或Hh途径抑制剂和其他类型的化学治疗，如TKI和含铂药物的联合治疗可缩小肿瘤体积，抑制肿瘤复发[32]。在以上研究基础上，对EGFR-TKI耐药的NSCLC患者用针对Gli蛋白的三氧化二砷治疗，但仍处于临床试验第一阶段；而近期通过在小鼠体内建立获得性EGFR-TKI耐药模型发现，Hh通路抑制剂sonidegib和相应的EGFR-TKI对Hh及EGFR的联合阻断，可显著降低癌细胞的转移，导致肿瘤体积缩小[33]；同时，研究又将目标转向Gli靶基因，如联合使用单克隆抗体白细胞分化抗原CD24和吉西他滨，在小鼠肺癌模型中能增强抗癌功效[34]。现有的多靶点药物，仅第17届世界肺癌大会上公布了一项入组40例曾接受多线治疗的晚期非鳞NSCLC前瞻性研究，结果显示阿帕替尼可调控Shh通路的活性，总缓解率和安全性比较理想，但仍缺乏大样本研究进一步验证。抗血管生成疗法是当前癌症药物开发的另一焦点，但尚未有联合Hh通路抑制剂抗肿瘤治疗的报道；在免疫治疗中也缺乏Hh通路的相关研究。现已发现部分天然产物的化合物及其衍生物可靶向Shh通路，如姜黄素、表儿茶素-3-没食子酸酯、异黄酮染料木黄酮、白藜芦醇、球姜酮、去甲斑蝥、三氧化二砷[35]，为靶向Hh治疗性抗癌剂的研究提供线索。

2.3 Hh信号通路在NSCLC耐药中的作用 肿瘤耐药、肿瘤微环境及肿瘤转移被Nature杂志评为癌症的三大谜团。现今关于肿瘤耐药机制研究，常见的学说有肿瘤微环境、ABC泵、肿瘤EMT、肿瘤干细胞、肿瘤免疫逃逸、表观遗传和肿瘤代谢、肿瘤耐药信号通路代偿作用等。因为Hh信号通路均参与上述学说，所以其已成为逆转肿瘤耐药的重要研究靶点。2013年，Kong等[36]发现Hh信号通路可通过调控EMT因子的表达从而维持人类髓性白血病细胞的耐药性，促进肿瘤细胞对化疗耐药。随后Bai等[32]体外研究也证实Hh信号通路异常激活后，NSCLC肿瘤细胞出现EMT表型，从而导致EGFR-TKI耐药。2014年达丽隽等[37]在对肺腺癌耐药株A549/顺铂(DDP)的研究中发现，Hh信号通路中的Gli1基因表达高于A549敏感株，沉默A549/DDP的G1i1，其对顺铂的敏感性可明显提高。近期Della等[38]指出，Hedgehog通路的激活是NSCLC获得对第一代、第二代和第三代EGFR-TKI耐药的共同特征，Hh通过诱导肿瘤EMT，导致其对EGFR-TKI产生抗性，通过SMO抑制剂sonidegib和EGFR-TKI联合阻断EMT后，肿瘤组织对于EGFR-TKI敏感性可恢复。上述研究证实，Hh通路在NSCLC治疗中参与肿瘤耐药，为NSCLC治疗耐药提供了一个可靠的抑制途径，也为耐药后的治疗提供了可能的逆转途径。

综上所述，Hh信号通路对于NSCLC的重要意义已毋庸置疑，虽然目前有一系列关于该途径的抑制剂，但药效不容乐观。因此必须更加深入地了解通路的作用机制，并且在未来的治疗方法开发中注重考虑冗余旁路和其他途径的串扰以及对表观遗传事件的干预等。还需进行大量的研究以了解Hh的分子机制。尽管肿瘤的耐药机制众说纷纭，但Hh通路介导的作用不容忽视，仍要在研究中注重对Hh通路组件的观察。为更好地控制NSCLC和其他恶性肿瘤的发生发展，应积极在Hh通路中寻找可能的恶性肿瘤预测因子和治疗位点。