细胞坏死性凋亡参与心肌损伤机制及治疗的研究进展

陈昊，夏正远

(广东医科大学附属医院，广东湛江524000)

细胞死亡根据形态学改变可分为三种不同的形式：Ⅰ型细胞死亡或凋亡，表现为细胞质收缩、核固缩、核碎裂和质膜起泡，最终形成明显的完整小囊泡(俗称凋亡小体)，囊泡被具有吞噬活性的相邻细胞吸收并在溶酶体中降解；Ⅱ型细胞死亡或自噬，表现为广泛的细胞质空泡化，同样最终导致吞噬细胞摄取和随后的溶酶体降解；Ⅲ型细胞死亡或坏死，表现为细胞胀大、胞膜破裂和细胞内容物外溢，引起严重的局部炎症反应。2005年，Degterev等[1]发现一种新的细胞死亡机制即坏死性凋亡。坏死性凋亡同时具有坏死和凋亡的特征。坏死性凋亡已被证实在心血管疾病(动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、心脏重塑等)发挥重要作用[2]。靶向坏死性凋亡的信号传导途径可为心血管疾病的治疗提供新的方向。心血管疾病是目前主要的死亡原因之一[3]。以往研究表明，心肌细胞主要死于坏死和凋亡。Kung等[4]提出坏死性凋亡为一种介导心血管疾病中细胞死亡的新机制。如果机体内细胞死亡不受限制，则可能发生组织损伤和退行性疾病。因此，了解坏死性凋亡参与心肌损伤的机制对于防治心肌损伤及功能衰退有重要意义。本文就坏死性凋亡在心肌细胞损伤中的作用机制作一综述。

1 细胞坏死性凋亡在心肌损伤中的作用机制

1.1 信号通路及其调控机制 细胞坏死性凋亡是由特异性死亡受体检测到细胞外或细胞内微环境紊乱而引发的调节性细胞死亡形式，其死亡受体包括(但不限于)自杀相关因子(FAS)和1型肿瘤坏死因子受体(TNFR1)[1,5～8]。此外，病原体识别受体如Toll样受体(TLR)3、TLR4和Z-DNA结合蛋白1也可介导细胞坏死性凋亡[9～11]。在分子水平上，坏死性凋亡严重依赖于蛋白激酶(RIP)3和混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的顺序激活[12,13]。在通过TNFR1启动坏死性凋亡时，RIP3被RIP1激活(在caspase-8无活性的情况下)，其机制涉及各自的RIP同型互作基序结构域与RIP1催化活性之间的相互作用[14～16]。有活性的RIP3催化MLKL磷酸化，导致MLKL寡聚体(多为三聚体或四聚体)形成并易位至质膜，通过翻转机制结合特定的磷脂酰肌醇磷酸酯类，从而引发质膜透化[13]。

通常细胞因子如RIP1、Fas相关死亡结构域蛋白、cylindromatosis、肿瘤坏死因子受体相关因子2(Traf2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和caspase-8可激活死亡受体而诱导凋亡。然而，当细胞凋亡受到抑制或caspase-8的活性减弱导致细胞凋亡未处于最佳状态时，可通过RIP1或RIP3介导坏死性凋亡。RIP1和RIP3是坏死性凋亡的特征性蛋白，是负责介导细胞死亡的重要激酶[17]。此外，MLKL也是坏死性凋亡的直接刽子手[18]。RIP1、RIP3和MLKL之间存在以下关系[19]：死亡受体的激活进一步激活RIP1，随后RIP1转移并结合RIP3与MLKL，最终形成复合物；当caspase-8被抑制时，RIP3与MLKL形成复合物诱导坏死性凋亡。

Guo等[20]通过抑制坏死性凋亡确定了Traf2在心肌存活和体内平衡中的关键作用。该研究表明，小鼠的心脏特异性缺失Traf2引发了心肌细胞的坏死性凋亡、病理性重塑和心力衰竭。Traf2缺陷小鼠血浆TNF-α水平升高，并且TNFR1的遗传消融在很大程度上消除了与Traf2缺失相关的病理性心脏重塑和功能障碍；从机制上讲，Traf2严格调控RIP1-RIP3-MLKL坏死性信号传导，肿瘤坏死因子相关死亡结构域蛋白为其上游调节因子，转化生长因子激酶1则为下游效应物；RIP3的遗传缺失在很大程度上挽救了由Traf2缺失引发的心脏重塑和功能障碍，证实了坏死性凋亡在调节病理性重塑和心力衰竭中起关键作用。

Luedde等[21]证实，RIP3过表达导致新生大鼠心室肌细胞中的RIP1蛋白水平降低。此外，Oerlemans等[22]证实，RIP1的化学抑制剂使得由缺血导致的心肌梗死面积减小。Adameova等[23]关于RIP1与缺血再灌注损伤的研究也得出了相同结论。说明RIP1参与了心肌梗死的病理生理过程。

除RIP3-MLKL复合物的构成外，RIP3还可以介导心肌中钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的活化以诱导细胞坏死性凋亡。Zhang等[24]的一项研究显示，RIP3通过激活CaMKⅡ而非通过RIP1和MLKL触发心肌坏死性凋亡；RIP3缺乏或CaMKⅡ抑制可改善由缺血再灌注或多柔比星治疗诱导的小鼠心肌坏死性凋亡和心力衰竭；RIP3诱导的CaMKⅡ活化触发线粒体通透性转换孔(mPTP)的开放和心肌细胞坏死性凋亡。该研究将CaMKⅡ鉴定为新的RIP3底物并诠释了RIP3-CaMKⅡ-mPTP心肌细胞坏死性凋亡途径，这将是治疗缺血和氧化应激诱导的心肌损伤和心力衰竭的有效靶标。

总之，心肌缺血再灌注损伤可引发两种坏死性凋亡途径，即RIP3-CaMKⅡ和RIP1-RIP3-MLKL；这些坏死性凋亡途径参与心肌细胞的初始损失，并且可能有助于过度氧化应激和缺血再灌注引起的额外损伤在整个心肌中扩散。

1.2 氧化应激 RIP3在心肌细胞中表达并与线粒体共定位，并与几种代谢酶(糖原磷酸化酶、氨酸-氨连接酶和谷氨酸脱氢酶1)相互作用。这些酶上调氧化磷酸化的底物，而氧化磷酸化是细胞中活性氧(ROS)的主要来源[25]，意味着氧化应激与坏死性凋亡之间存在必然联系。

糖尿病性心肌病(DCM)是糖尿病的一种严重并发症，高糖诱导的心肌细胞死亡是DCM发生的启动因素，而氧化应激与炎症反应参与此过程。ROS通过对细胞重要成分的氧化作用促进细胞死亡，提示其可能与坏死性凋亡存在一定联系。Liang等[26]在高糖诱导H9C2心肌细胞损伤的模型中证实，特异性阻断坏死性凋亡能减轻高糖所致的细胞毒性、线粒体损伤及氧化应激，而ROS清除剂N乙酰半胱氨酸也明显抑制高糖引起的细胞毒性及坏死性凋亡的效应分子RIP3的表达。

1.3 自噬 自噬对于细胞生存是一把双刃剑，适量自噬有助于细胞存活，而过度自噬则引起细胞死亡。Ogasawara等[27]研究探讨了mPTP和自噬在心肌细胞死亡中的作用，结果显示，抑制自噬流有助于RIP1与RIP3相互作用，并促进心肌细胞的坏死性凋亡；p62与RIP1的相互作用可以隔离p62与微管相关蛋白轻链3Ⅱ的相互作用，此为抑制自噬的基础；然而，mPTP并非引起心肌细胞坏死性凋亡的主要执行者。该研究提示RIP1是调控自噬与坏死性凋亡的关键节点，说明其可能成为治疗心肌损伤的新靶点。

此外，对心肌细胞过度自噬的抑制作用同样也能抑制坏死性凋亡。在特定条件下，自噬可以直接或间接诱导包括坏死性性凋亡在内的细胞死亡。Liu等[28]发现，抑制热休克蛋白70(HSP70)表达可促进缺氧/复氧处理后的心肌细胞自噬和坏死性凋亡，而这种趋势会被自噬抑制剂3-Methyladenine逆转，表明自噬诱导的坏死性凋亡可被HSP70抑制。总之，HSP70通过抑制心肌缺血再灌注期间的自噬来下调心肌细胞的坏死性凋亡，揭示了HSP70的保护新机制，并为缺血性心脏病的治疗提供了新的分子靶点。

1.4 miRNAs miRNAs是一种高度保守的小型非蛋白质编码RNA，具有微调数百种基因表达的能力。研究表明，miRNAs在缺血再灌注心脏中失调，并在缺血再灌注期间积极参与心肌细胞死亡的调节[29]。Qin等[30]观察到miR-223的两条链(5p和3p)在缺血再灌注小鼠的心脏中失调；与野生型小鼠相比，miR-223前体(pre-miR-223)转基因小鼠的心脏在离体和体内心肌缺血时均表现出更好的再灌注期收缩性能恢复和更小的心肌坏死，pre-miR-223敲除小鼠心脏则显示相反的效果；此外，RIP1/RIP3/MLKL坏死性途径和炎症反应在转基因心脏中被抑制，而在pre-miR-223敲除小鼠心脏缺血再灌注后被激活。上述研究确定了两个关键细胞死亡受体TNFR1和死亡受体6作为miR-223-5p的直接靶标，而miR-223-3p则直接靶向与炎症和坏死性凋亡相关的NLRP3和IKKα两种介质。表明miR-223-5p/-3p双链体在多个层面协同抑制缺血再灌注诱导的心肌坏死，因此pre-miR-223有潜力作为改善缺血性心脏病的新治疗剂。

Yang等[31]使用miRNA组学分析检测了硒缺陷心脏的特异性miRNAs。该研究使用硒缺陷鸡的心脏组织进行高通量测序，确认了差异表达的miR-200a-5p和靶基因环指蛋白11之间的关系；并进一步观察到miR-200a-5p过表达在体内和体外激活RIP3依赖的坏死性凋亡。caspase的抑制剂z-VAD-fmk未能诱导坏死性凋亡，而在miR-200a-5p敲低后，其对心肌细胞坏死的抵抗及细胞存活率均有增加。该研究说明，miR-200a-5p及其靶基因的调节可能阻断心肌细胞的坏死性凋亡。

2 坏死性凋亡在心肌损伤治疗中的作用

理论上抑制坏死性凋亡对心肌具有保护作用[32～34]。然而，RIP1的化学抑制剂在高浓度条件下反而诱导心肌损伤[34]。此外，肝细胞生长因子(HGF)通过抑制心肌梗死后细胞凋亡及促进细胞坏死性凋亡和自噬对心肌产生保护作用[35]。源于天然药物的提取物也对心肌细胞的坏死性凋亡产生影响[36]。

2.1 RIP1抑制剂 RIP1被认为是参与动员坏死性凋亡的主要上游激酶，坏死性凋亡抑制剂necrostatin-1(Nec-1)是RIP1的抑制剂，可防止化学和物理引起的组织损伤。Dmitriev等[32]在大鼠离体心脏模型中研究了Nec-1的心脏保护作用，发现冠状动脉内注射Nec-1会导致左心室收缩压升高，产生正性肌力作用，但不会缩小梗死区域。另有研究表明，在缺血再灌注损伤后给予Nec-1可降低体内RIP1/3磷酸化，Nec-1对心肌缺血再灌注后的短期和长期心脏功能有保护作用[22]。Chua等[33]研究发现，在缺血前和再灌注后Nec-1均可减少小鼠心肌梗死面积；Nec-1在z-VAD-fmk存在的条件下可降低血浆肌钙蛋白I的水平并诱导额外的保护作用。说明Nec-1可抑制心肌梗死中心肌细胞的坏死性凋亡，其通过不依赖caspase的机制发挥心脏保护作用。此外，Nec-1还可减少过氧化物诱导的C2C12成肌细胞和H9C2心肌细胞死亡，该作用机制在于Nec-1延迟了mPTP的开放[34]；但是高浓度的Nec-1还可产生非特异性或毒性作用，促进心肌细胞死亡[34]。

2.2 基因调控 调控某些基因的表达也可影响心肌细胞的坏死性凋亡。Liu等[35]研究结果显示，心肌梗死后自噬、细胞凋亡和坏死性凋亡的分布在不同的时间和空间各有不同；值得注意的是，腺病毒载体(Ad)-HGF治疗通过保留心脏功能，减少瘢痕大小和聚集体来改善心肌梗死后SD大鼠的心脏重塑。进一步研究表明，Ad-HGF促进自噬和坏死性凋亡，并在体内和体外抑制细胞凋亡；Ad-HGF降低了caspase-8的蛋白表达及其活性，使细胞在缺氧条件下发生坏死并阻断细胞凋亡。因此，调节心肌细胞的死亡形式可能比单独抑制坏死性凋亡更有意义。

2.3 天然化合物 Chtourou等[36]在研究中强调天然化合物柚皮素(NGEN)对高胆固醇饮食大鼠心脏组织的保护作用及NGEN抑制心肌坏死性凋亡途径的潜在分子机制。研究发现，暴露于高胆固醇饮食90 d的动物表现出血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶、一氧化氮、蛋白质和脂质氧化标志物及心脏脂质谱水平升高；此外，高胆固醇血症降低了与线粒体功能障碍相关的酶类和非酶类抗氧化剂的水平；重要的是，高胆固醇饮食增加ROS和核DNA损伤，并导致TNF-α和RIP3基因表达和激活，说明胆固醇诱导了心肌细胞的坏死性凋亡；对高胆固醇饮食大鼠给予NGEN可改善以上指标。

目前大多数研究未详细说明在各种原因导致的心肌细胞死亡中坏死性凋亡所占比例及其重要程度。今后的研究应关注坏死性凋亡与其他类型的心肌细胞死亡之间的联系，从整体水平探索干预心肌损伤的防治策略。