益生芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的研究进展

■杨桂林 肖 丹 潘康成

（四川农业大学动物医学院动物微生态研究中心，四川成都611130）

黄曲霉毒素是一类由某些真菌产生的毒素，广泛存在于玉米、花生、谷类等农作物籽实中，对食品业和畜牧业造成了巨大的危害。奶牛摄入黄曲霉毒素会导致其采食量下降，免疫力下降，内脏器官受损甚至癌变，产奶量下降等危害，且饲喂黄曲霉毒素时间越长，危害越大[1]。黄朝芳等[2]发现黄曲霉毒素可对水产动物有肝毒性、致癌性、致畸性、致突变和免疫抑制等危害。赵红梅等[3]发现，猪黄曲霉素中毒导致出现食欲减退、腹泻、皮炎、共济失调、死亡等症状。家禽黄曲霉毒素中毒表现为肝脏、肾脏、肠道等内脏器官损伤，口腔溃烂、免疫功能下降、产蛋下降、生长速度下降等症状[4]。减少食品及饲料中的黄曲霉毒素残留，降低黄曲霉毒素对畜禽和人类的威胁迫在眉睫。

1 黄曲霉毒素的脱除方法

控制黄曲霉素中毒发生最常用的方法是做好防霉工作，如将饲料放置在干燥的地方，在饲料中添加防霉剂等。而对于存在于原料或饲料中的黄曲霉毒素，高效的黄曲霉毒素脱除方法就显得尤其重要了。目前，黄曲霉毒素的脱除方法主要包括物理脱除法、化学脱除法、生物脱除法，但由于黄曲霉毒素的性质稳定，导致对使用物理脱除法和化学脱除法时采取的反应条件较高，因此可能对饲料中营养成分的破坏较大，同时可能造成其它有毒物质的残留[5]。随着酶工程，基因工程等学科的发展，生物脱除技术由于其反应条件温和，降解效率高，不会产生对人和动物有害的物质，已成为最优的黄曲霉毒素降解方法之一[6]。生物脱除法即利用微生物或其代谢产物进行解毒[7]，目前国际上已发现的可降解黄曲霉毒素的微生物有芽孢杆菌[8]、乳酸菌[9]、酿酒酵母[10]、鼠李糖乳杆菌[11]、橙色黄杆菌[12]、树状指孢霉[13]、分支杆菌胞外提取物[14]等。

2 益生芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的研究

益生芽孢杆菌是一类严格好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性菌，广泛分布于水、空气、尘粒、土壤中，并能通过呼吸、饮水、采食等进入动物肠道内[15-17]。目前，益生芽孢杆菌已广泛应用于畜禽生产中，其种类包括枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等[18]。益生芽孢杆菌可以降解黄曲霉素[19]、有机磷农药[20]、扑草净[21]、多菌灵[22]、玉米霉烯酮、呕吐毒素[23]等有毒物质。

2.1 益生芽孢杆菌在体外降解黄曲霉毒素

益生芽孢杆菌在体外降解黄曲霉毒素的能力可以利用来减少农产品中产黄曲霉毒素真菌的滋生及黄曲霉毒素的残留，以提升食品及畜禽饲料的安全性。RAO 等[24]以香豆素作为唯一碳源，分离出7种在液体培养基中使黄曲霉毒素降解70%以上的菌株，其中一菌株降解率甚至达到了94.7%，经16SrRNA 测序鉴定出该菌株属于地衣芽孢杆菌。Farzaneh 等[25]报道了从开心果中分离的枯草芽孢杆菌UTBSP1 对黄曲霉毒素降解率可以达到95%。Gao 等[26]从鱼的肠道中分离出枯草芽孢杆菌ANSB060，该菌株对黄曲霉毒素B1、M1 和G1 降解率分别为81.5%、60%和80.7%，此外，他们所分离的菌株可以抑制病原体的生长并抵抗模拟肠道环境中的不利条件。Petchkongkaew 等[27]将分别从泰国北部的大豆和新鲜豆豉分离出来的23 株芽孢杆菌与一株产黄曲霉毒素的菌株共同培养，结果发现大多数芽孢杆菌均可以抑制毒株的生长和降解黄曲霉毒素，且降解能力最强的两种菌株分别为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。Siahmoshteh 等[19]对两种芽孢杆菌的抗霉菌和抗黄曲霉菌毒素能力进行了评估，发现两种细菌菌株在体外条件下和开心果籽中均显示出良好的抗霉菌活性和黄曲霉毒素降解能力，为芽孢杆菌属物种开发、对抗产毒性真菌的生长和农作物的黄曲霉毒素污染生物防治剂提供了依据。Galarza-Seeber 等[28]通过利用体外消化模型模拟体内条件，对适应体内生理环境的芽孢杆菌降解黄曲霉素的能力进行了评估，发现对黄曲霉毒素具有强降解能力的3 株菌株，分别为解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌。这些具有体外降解黄曲霉毒素能力的益生芽孢杆菌，都具有开发为生物制剂的潜能。

2.2 益生芽孢杆菌在体内降解黄曲霉毒素

将益生芽孢杆菌制成微生态制剂添加到畜禽的饲料中，其进入动物胃肠道，发挥益生作用，若其具有降解黄曲霉毒素的能力，当畜禽受到含有黄曲霉毒素的饲料威胁时，可以为畜禽提供一定的保护力，帮助动物代谢黄曲霉毒素，降低黄曲霉毒素的危害及黄曲霉毒素的残留。Fan 等[29]通过对照试验，发现枯草芽孢杆菌ANSB060 可以抵消黄曲霉毒素对肉鸡生长性能的影响和对肉质的破坏作用，同时能减少喂食天然发霉花生粕的肉鸡肝脏中黄曲霉毒素残留量。Ma等[30]研究了一株分离自鱼肠的枯草芽孢杆菌对饲喂黄曲霉毒素蛋鸡蛋品质、蛋鸡肝脏、肾脏生化和组织病理学变化的保护作用，结果显示该芽孢杆菌可以增强蛋鸡抗氧化活性，恢复肝脏中的蛋白质合成，此外，还改善了肝脏和肾脏组织的损伤，并使其恢复正常。王大才等[31]在含有黄曲霉毒素B1 的基础日粮中添加枯草芽孢杆菌制剂，发现在黄曲霉毒素B1 含量为55 μg/kg 时，枯草芽孢杆菌制剂的添加量为0.2% 时其解毒效果最好，基本减轻或消除黄曲霉毒素B1 对黄河鲤鱼生长、血清相关酶活和蛋白指标、营养物质消化率及肝、肌肉黄曲霉毒素B1 残留的不良影响。Fan 等[32]还研究发现黄曲霉毒素会增加血清中天冬氨酸转氨酶活性，降低血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性，增强血清和肝脏中丙二醛含量，引起肝组织严重的病变，如胆管上皮增生、空泡变性和淋巴细胞浸润等，但饲喂枯草芽孢杆菌可降低十二指肠中的黄曲霉毒素水平，并抵消黄曲霉毒素的负面影响，从而得出枯草芽孢杆菌对饲喂黄曲霉毒素的肉鸡具有保护作用的结论。宋文静等[33]研究表明，在肉鸭日粮中添加益生芽孢杆菌制剂可以有效降低黄曲霉毒素在肝脏、肌肉组织中的残留。Barati等[34]研究发现使用益生芽孢杆菌+乳杆菌+酿酒酵母细胞壁制成的混合微生态制剂可以控制黄曲霉毒素对体液和细胞免疫系统的抑制作用，这种制剂通过降低黄曲霉毒素的抗营养作用，同时改善蛋白质合成过程，增加抗体产生和对绵羊血红细胞注射的反应，从而提出使用益生元和益生菌的混合物控制黄曲霉毒素对雏鸡的影响，改善免疫功能和生化途径的方法。大量的研究发现了益生芽孢杆菌在体内对黄曲霉毒素的降解能力及其对黄曲霉毒素对机体造成的不良影响的消除，为进一步将益生芽孢杆菌开发成为防止畜禽黄曲霉毒素中毒的微生态制剂奠定了基础。

3 益生芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的可能机制

益生芽孢杆菌在生命活动中会产生一系列脂肽、蛋白质、表面活性素等中间产物或代谢产物，其中部分产物可能兼有对黄曲霉毒素的降解作用[35-42]。此外，由于益生芽孢杆菌的增殖周期较短，在与产黄曲霉毒素的真菌共存时，两者竞争营养物质、水等生存物资，从而与产黄曲霉毒素真菌形成拮抗作用。Gao 等[26]发现，枯草芽孢杆菌培养72 h 后培养物上清液能够降解78.7%的黄曲霉毒素B1，而活细胞和细胞提取物分别降解10.5%和9.6%，培养物上清液也具有强烈的黄曲霉毒素G1 和M1 降解活性，比活细胞和细胞壁提取物显著，这表明该芽孢杆菌的降解黄曲霉毒素的活性物质主要在其代谢产物中。Xu等[35]从玉米、水稻和土壤样品中分离出43 种细菌，从中筛选了一株对黄曲霉毒素降解能力最强的菌株，经鉴定其属于芽孢杆菌属，研究发现该菌株培养上清液比活细胞和细胞提取物降解更多的黄曲霉毒素，且在蛋白酶K 和十二烷基硫酸钠存在时，降解活性从77.9%降低到15.3%。他们发现将上清液培养24 h后的黄曲霉毒素降解能力通过超滤浓缩50倍后从47.6%增加至70.1%，并且与蛋白质浓度呈正相关，他们再将上清液煮沸10 min，毒素降解能力没有改变。他们进一步从煮沸的上清液中纯化出了这些热稳定酶，命名为芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶（BADE）。Xia 等[36]从土壤中分离出可以抑制黄曲霉生长和降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌JSW-1，经研究发现枯草芽孢杆菌JSW-1 的黄曲霉毒素降解活性主要归因于无细胞上清液，且活性物质同样耐高温但对蛋白酶K 敏感，表明益生芽孢杆菌的胞外蛋白或酶具有黄曲霉毒素降解活性。Mohsen 等[37]用枯草芽孢杆菌UTBSP1 处理开心果，可使开心果中的黄曲霉毒素含量减少，用荧光探针法发现枯草芽孢杆菌UTBSP1 的无细胞上清液显著影响孢子活力，使用高效液相色谱方法从无细胞上清液的甲醇提取物中分离了10 个组分，其中两个组分具有抑制黄曲霉的能力。质谱分析发现，两种抗真菌组分的抗菌复合物、表面活性素的环脂肽和丰原素具有高度相似性，推测枯草芽孢杆菌是通过表面活性素与丰原素的协同作用产生强烈的抗真菌作用。Mohammadipour等[38]从枯草芽孢杆菌分离出了许多表面活性素，发现纯化的表面活性素对黄曲霉生长的具有强烈的抑制作用。Landy 等[39]从枯草芽孢杆菌分离得到了对黄曲霉毒素具有抑制作用的杆菌霉素D，杆菌霉素D是芽孢杆菌分泌的一种抗菌脂肽，属于伊枯草菌素家族，对蛋白酶不敏感[40]。Gu 等[41]进一步发现，杆菌霉素D作用于真菌细胞膜和细胞壁，使其形态发生变化，诱导活性氧的积累，最终导致真菌死亡。Afsharmanesh等[42]研究发现，枯草芽孢杆菌UTB1 的黄曲霉毒素降解能力是基于参与杆菌溶素生物合成的氧化还原酶的产生。目前，还没有形成益生芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的作用机理的统一看法。

4 益生芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的影响因素

4.1 菌种

菌种是影响益生芽孢杆菌降解黄曲霉毒素最主要的因素，不同的芽孢杆菌对黄曲霉毒素降解能力不尽相同，有些菌株甚至没有降解黄曲霉毒素的能力。根据目前的研究结果来看，益生芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的主要原因是能产生一些具有降解黄曲霉毒素活性的酶类、表面活性素等胞外代谢产物[35-42]。因此，选择具有高效降解黄曲霉毒素的芽孢杆菌作为待选菌种就格外重要了，此外，芽孢杆菌作为一类常见的饲料添加剂，其益生的特性在选择时也值得被考虑。若需将益生芽孢杆菌添加在饲料中作为预防黄曲霉毒素中毒的一种措施，最优的选择就是该益生芽孢杆菌既能增加动物的生长性能，增强动物的免疫力，又具有较好的黄曲霉毒素降解作用。若将益生芽孢杆菌作为体外发酵降解黄曲霉毒素的菌种时，尽可能高的黄曲霉毒素降解率就是选择的首要考虑因素了。目前，枯草芽孢杆菌是最常见，且应用最广泛的益生芽孢杆菌。

4.2 环境

益生芽孢杆菌所处的环境对其降解黄曲霉素的能力具有巨大影响。有研究发现，有的益生芽孢杆菌在体外可以降解黄曲霉毒素，但通过拌料饲喂的时候却未能表现明显的黄曲霉毒素降解作用[43]。由于益生芽孢杆菌主要依靠其代谢产生的物质来达到降解黄曲霉毒素的作用，而细菌的代谢产物是随着环境的pH 值、温度、湿度、含氧量等因素变化的，所以，确定适宜的培养条件，可以大大提高益生芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的效率。Farzaneh等[25]发现无细胞上清液对黄曲霉毒素B1 降解的最佳温度为35～40 ℃，最佳作用时间为24 h。Rao等[24]发现一株地衣芽孢杆菌最佳降解黄曲霉毒素B1的培养温度为37 ℃，时间为24 h，pH值为7。

5 小结与展望

益生芽孢杆菌作为一类已被大众广泛认可的益生菌，其无毒副作用、无残留、效果显著。由于益生芽孢杆菌能形成芽孢，其芽孢耐高温、耐强酸碱，因此较其他益生菌而言，更适合运输、保存，通过动物肠胃的效率更高。目前，益生芽孢杆菌已作为微生态制剂添加在畜禽的饲料中，以调节动物的肠道微生态平衡、增强动物免疫功能、促进消化与吸收、提高动物的生产性能等。本实验室研究发现，霉菌毒素分解酶枯草杆菌制剂可以降低黄曲霉毒素在体内的残留，改善黄曲霉毒素B1 造成的肉鸡生长受阻、免疫器官发育受损、抗氧化功能下降等现象。益生芽孢杆菌用来降解黄曲霉毒素的研究已经有很长时间，目前已经达到了应用阶段，但是关于益生芽孢杆菌杆菌降解黄曲霉毒素的机理却依然不是很清楚。国内外研究益生芽孢杆菌在体外降解黄曲霉毒素较多，但是益生芽孢杆菌杆菌在动物机体内降解黄曲霉毒素，为动物的提供保护作用的相关研究却较少。因此，我们还需要去发现更多对黄曲霉毒素有高效降解作用的益生芽孢杆菌，探究其降解黄曲霉毒素的作用机理。